劉 穎， 紀(jì) 超， 吳偉康

(1廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510006； 2中山大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，廣東 廣州 510089)

1000-4718(2012)03-0459-05

2011-10-12

2011-12-05

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2008B060600055)

△通訊作者Tel:020-39352121； E-mail:13322819916@163.com

附子多糖保護(hù)缺氧/復(fù)氧乳鼠心肌細(xì)胞及其抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制研究*

劉 穎1△， 紀(jì) 超1， 吳偉康2

(1廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510006；2中山大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，廣東 廣州 510089)

目的觀(guān)察附子多糖對(duì)缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞的保護(hù)，并探討附子多糖的保護(hù)機(jī)制是否與其抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。方法建立乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，將乳鼠心肌細(xì)胞分為正常對(duì)照組、缺氧/復(fù)氧組(缺氧3 h后復(fù)氧6 h)和不同濃度附子多糖(0.1 g/L、1 g/L、10 g/L、20 g/L)+缺氧/復(fù)氧組。MTT法測(cè)定心肌細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率，Western blotting分析葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)及caspase-12的表達(dá)，熒光定量PCR進(jìn)一步檢測(cè)CHOP及caspase-12 mRNA表達(dá)。結(jié)果缺氧復(fù)氧后，心肌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志蛋白GRP78表達(dá)增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡相關(guān)蛋白CHOP及caspase-12蛋白和mRNA表達(dá)亦明顯升高。與缺氧/復(fù)氧組相比較，附子多糖預(yù)處理24 h后可以有效抑制缺氧/復(fù)氧引起的GRP78、 CHOP和caspase-12的表達(dá)上調(diào)，增加心肌細(xì)胞的存活率，抑制心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。附子多糖的保護(hù)效應(yīng)呈劑量依賴(lài)形式，10 g/L劑量時(shí)達(dá)到峰值。結(jié)論附子多糖保護(hù)缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞的可能機(jī)制與其抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)。

附子多糖； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 缺氧/復(fù)氧損傷; 心肌細(xì)胞

心肌缺血再灌注損傷是臨床上常見(jiàn)的病理過(guò)程，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及多方面因素[1]。近年來(lái)研究證實(shí)，心肌缺血再灌注過(guò)程中引發(fā)的氧化應(yīng)激、鈣超載、ATP耗竭等將誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，過(guò)度ERS介導(dǎo)的心肌細(xì)胞功能的障礙及心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)一步參與了缺血再灌注損傷的發(fā)生[2]。附子多糖(Fuzi polysaccharide，F(xiàn)PS)是從中藥附子中提取分離的多糖成分，新近研究提示，附子多糖具有良好的抗心肌氧化應(yīng)激損傷的作用[3]。但附子多糖能否對(duì)抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮對(duì)心肌的保護(hù)，尚未見(jiàn)報(bào)道。由于缺氧和缺血有著極其相似的病理改變和發(fā)病機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以缺氧/復(fù)氧乳鼠心肌細(xì)胞模型模擬在體心肌缺血再灌注損傷，觀(guān)察FPS對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)，和對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)促凋亡蛋白 (CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)和cas-pase-12表達(dá)的影響，探討附子多糖能否通過(guò)抑制ERS來(lái)保護(hù)心肌細(xì)胞，對(duì)抗缺氧/復(fù)氧引起的損傷，從而為深入闡明附子多糖的藥理作用提供新的實(shí)驗(yàn)資料。

材 料 和 方 法

1材料

1.1藥物 鑒定合格的附子多糖由中山大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所提供[4]，分子量14 kD，純度大于99.8%。使用時(shí)溶于細(xì)胞培養(yǎng)液中配成實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.2動(dòng)物 出生48 h內(nèi)的SD乳鼠(購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK 粵2008-0020)。

1.3主要試劑 胰蛋白酶(BioSHARP)，Ⅱ型膠原酶(Sigma)，青-鏈霉素溶液(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基及DMEM低糖培養(yǎng)基(Hyclone)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；AnnexinⅤ-FITC試劑(Beckman Coulter)；兔抗大鼠GRP78、CHOP、caspase-12及GAPDH抗體(Cell Signaling Technology)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、胞漿蛋白抽提試劑盒(碧云天生物科技研究所)；WB超敏發(fā)光液(北京普利來(lái)基因有限公司)；Trizol、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和RNasin (Invitrogen)，Thunderbird SYBR?Green qPCR Mix(QPS-201)(Toyobo)。

1.4儀器 ELx800酶標(biāo)儀(BioTek)；Centrifuge 5804R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Eppendorf)；Coulter Epics XL流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)；MiniOpticon Real-time PCR儀(Bio-Rad)；垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(C.B.S. Scientific)；凝膠成像系統(tǒng)(Vilber Lourmat)；CO2培養(yǎng)箱(Model TC2323)(Shel Lab)。

2方法

2.1乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 無(wú)菌操作取出乳鼠心臟，剪碎，消化法分離心肌細(xì)胞。收集消化液后經(jīng)200目篩過(guò)濾制成單細(xì)胞懸液，離心棄上清，用含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，差速貼壁培養(yǎng)90 min，去除成纖維細(xì)胞。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至5×108/L接種于96孔板，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48 h后換含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，待細(xì)胞基本融合成片，選擇生長(zhǎng)良好、搏動(dòng)規(guī)律的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的建立 不含血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，純氮1 L/min流量充分飽和30 min，用上述培養(yǎng)基置換正常培養(yǎng)基，將細(xì)胞放入密封袋充入高純度氮?dú)?，密封放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)為缺氧；用含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液置換培養(yǎng)基，置于95%O2+5%CO2培養(yǎng)箱常氧培養(yǎng)為復(fù)氧。

2.3實(shí)驗(yàn)分組 將心肌細(xì)胞分為3組：(1)正常對(duì)照(Control)組：用含15%血清的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)9 h；(2)缺氧/復(fù)氧(H/R)組：缺氧3 h后復(fù)氧6 h；(3)附子多糖+缺氧/復(fù)氧(FPS+H/R) 組：將心肌細(xì)胞置入不同濃度的(0.1 g/L、1 g/L、10 g/L、20 g/L)附子多糖培養(yǎng)液中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，缺氧3 h后復(fù)氧6 h。

2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每孔加入5 mg/L噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl tetrazolium bromide，MTT)溶液20 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)液體，每孔加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)150 μL，搖床10 min,待結(jié)晶充分溶解后，590 nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)光吸收值。細(xì)胞存活率(%)=處理組A590/正常組A590×100%。

2.5細(xì)胞凋亡率 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集細(xì)胞，用0.02%EDTA消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，用Annexin V-FITC試劑盒中binding buffer懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×109cell/L，取100 μL細(xì)胞，分別加入碘化丙啶(propidium iodide,PI) 和膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)，避光冰浴10 min，上機(jī)檢測(cè)。

2.6GRP78、CHOP和caspase-12的Western blotting分析 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白, Bradford 法測(cè)蛋白濃度。取樣品蛋白質(zhì) 30 μg行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維膜，5%封閉液封閉2 h，分別加入GRP78(1∶200)、CHOP(1∶200)和caspase-12(1∶200)抗體，和上樣對(duì)照GADPH抗體(1∶400)，4 ℃孵育過(guò)夜。加入Ⅱ抗(1∶1 000)，37 ℃振蕩孵育1 h。 ECL顯色，放射自顯影檢測(cè)。以GAPDH作內(nèi)參照，分析GRP78、CHOP和 casepase-12蛋白條帶掃描灰度變化。

2.7熒光定量PCR測(cè)定CHOP和caspase-12 mRNA的表達(dá) 提取心肌細(xì)胞總RNA。所有實(shí)驗(yàn)用品均預(yù)先進(jìn)行去RNA酶處理, 整個(gè)過(guò)程在冰浴中進(jìn)行。采用逆轉(zhuǎn)錄酶及隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng), 嚴(yán)格按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物由上海英俊公司合成。CHOP上游引物5’-TGTTGAAGATGAGCGGGTG-3’，下游引物5’-CAAGGTGAAAGGCAGGGACTC-3’；Casepase-12序列，上游引物5’-ATTCCTGGTCTTTATGTCCC-3’，下游引物5’-ATACTCTCTCAATGGTGGGC-3’；β-actin上游引物5’-CTATTGGCAACGAGCGGTT-3’，下游引物5’-GGCATAGAGGTCTTTACGGATGT-3’。采用高溫啟動(dòng)法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR循環(huán), 擴(kuò)增的每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)均設(shè)內(nèi)參對(duì)照, 每個(gè)指標(biāo)均有正常組作對(duì)照。進(jìn)行PCR 循環(huán)擴(kuò)增(40個(gè)循環(huán)) , 循環(huán)條件(兩步法， 退火60 ℃，延伸72 ℃)。取相對(duì)定量( relative quantity, RQ)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1心肌細(xì)胞存活率

與正常對(duì)照組相比，缺氧/復(fù)氧組的細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.01)。經(jīng)FPS預(yù)處理24 h后，與缺氧/復(fù)氧組相比， FPS呈劑量依賴(lài)性增加心肌細(xì)胞的存活率，在10 g/L時(shí)基本達(dá)到飽和，20 g/L時(shí)心肌細(xì)胞存活率增幅趨緩，見(jiàn)表1。

表1各組心肌細(xì)胞存活率、凋亡率以及CHOPmRNA和casepase-12mRNA表達(dá)量的比較

GroupDose(g/L)Survivalrate(%)Apoptoticrate(%)CHOPmRNARQCaspase-12mRNARQControl-1004.80±0.65 11H/R-52.32±2.90**18.09±1.66**1.76±0.29**1.87±0.31**FPS+H/R2072.58±2.31△△14.26±1.98△△1.29±0.09△△1.32±0.25△△FPS+H/R1072.41±2.52△△14.17±1.11△△1.31±0.12△△1.33±0.19△△FPS+H/R168.97±2.33△△16.99±1.66△1.57±0.08△1.62±0.17△FPS+H/R0.158.62±2.14△17.92±1.451.72±0.271.86±0.33

**P<0.01vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsH/R group.

2心肌細(xì)胞凋亡率

缺氧/復(fù)氧后，心肌細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，與正常對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.01)。經(jīng)不同濃度的FPS預(yù)先處理后，F(xiàn)PS可劑量依賴(lài)地減少缺氧/復(fù)氧所造成的細(xì)胞凋亡，1 g/L時(shí)開(kāi)始具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，10 g/L時(shí)達(dá)到峰值,見(jiàn)表1、圖1。

Figure 1. Flow cytometry showed the changes of cell apoptosis among various groups.A:control; B:H/R; C～F:FPS (20, 10, 1 and 0.1 g/L, respectively)+H/R.

圖1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡的變化

3GRP78、CHOP和caspase-12的蛋白表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，缺氧/復(fù)氧后GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表達(dá)均明顯增加。不同濃度的FPS預(yù)處理，1 g/L濃度以上時(shí)可以抑制GRP78、CHOP和caspase-12的表達(dá)，與缺氧復(fù)氧組對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在10 g/L時(shí)，對(duì)CHOP和caspase-12蛋白表達(dá)的抑制基本飽和，見(jiàn)圖2。

圖2各組心肌細(xì)胞GRP78、CHOP和casepase-12蛋白表達(dá)的比較

4CHOPmRNA和caspase-12mRNA表達(dá)

缺氧/復(fù)氧后CHOP mRNA及caspase-12 mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)。FPS干預(yù)后，F(xiàn)PS組與缺氧/復(fù)氧組相比，可劑量依賴(lài)地抑制CHOP mRNA及caspase-12 mRNA表達(dá)，濃度達(dá)到1 g/L時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，10 g/L時(shí)達(dá)到峰值，見(jiàn)表1。

討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成折疊、鈣儲(chǔ)存的重要場(chǎng)所。當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)外因素的影響下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)遭到破壞，導(dǎo)致大量錯(cuò)誤或者未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中聚集，激活相應(yīng)的信號(hào)通路，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列的反應(yīng)，稱(chēng)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[5]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括：PERK (protein kinase R-like ER kinase)通路、ATF6(activating transcription factor 6)通路和IRE1( inositol requiring enzyme 1)通路，轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78結(jié)合了錯(cuò)誤折疊及未折疊蛋白質(zhì)后，與3種感應(yīng)蛋白分離密切相關(guān)。因此，GRP78被視為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的感受器，其表達(dá)上調(diào)標(biāo)志ERS的發(fā)生。ERS是細(xì)胞的一種自我保護(hù)性機(jī)制，當(dāng)嚴(yán)重的或長(zhǎng)時(shí)間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能時(shí)，將誘導(dǎo)凋亡通路的激活而觸發(fā)細(xì)胞死亡[6]。ERS是繼死亡受體活化、線(xiàn)粒體損傷途徑后發(fā)現(xiàn)的一條重要的細(xì)胞凋亡途徑，CHOP基因的激活轉(zhuǎn)錄和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的caspase-12 的激活通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞凋亡通路的重要組成[7]。

新近的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其誘導(dǎo)的凋亡與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Xin等[6]發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注能夠激活GRP78和CHOP的表達(dá)。Zhang等[7]也在離體心臟模型上進(jìn)一步證實(shí)了，缺血再灌注導(dǎo)致 ERS，促進(jìn) CHOP 的表達(dá)升高和caspase-12 裂解。而CHOP基因缺失小鼠，其再灌注后心肌梗死面積縮小伴隨細(xì)胞凋亡率的降低[8]。本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到，心肌缺氧復(fù)氧后，心肌細(xì)胞存活率下降，凋亡率升高，伴隨GRP78、CHOP、caspase-12的表達(dá)明顯增加。分析原因?yàn)?，缺氧?fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生ERS，強(qiáng)烈的ERS激活了CHOP、caspase-12，進(jìn)而引起隨后的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

目前，基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制，研發(fā)心肌缺血再灌注損傷保護(hù)的新策略成為研究的增長(zhǎng)點(diǎn)。近年來(lái)，中藥多糖因?yàn)楦咝У投镜奶攸c(diǎn)成為藥物開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。資料表明，許多中藥多糖具有提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，從而保護(hù)生物膜的作用[9]。附子多糖是從附子中提出的一種多糖化合物，具有一個(gè)半縮醛羥基，能和活性氧發(fā)生反應(yīng)，直接清除自由基，對(duì)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)的細(xì)胞具有保護(hù)作用，但目前對(duì)其功能的研究報(bào)道甚少。劉古鋒等[3]證明，予附子多糖處理后，能夠明顯提高心肌組織抗氧化酶的活性，減少小鼠力竭運(yùn)動(dòng)所致的氧化應(yīng)激損傷，提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力。附子多糖還可以通過(guò)上調(diào)抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)，抑制凋亡蛋白酶caspase-3的活化，實(shí)現(xiàn)抗凋亡的作用[10]。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平，觀(guān)察附子多糖對(duì)缺氧復(fù)氧乳鼠心肌損傷的影響。結(jié)果顯示，予以附子多糖預(yù)先處理后，附子多糖可以逆轉(zhuǎn)缺氧復(fù)氧所造成的心肌細(xì)胞存活率的下降和凋亡率的升高，同時(shí)，附子多糖抑制GRP78、CHOP、caspase-12蛋白及CHOP、caspase-12 mRNA的表達(dá)，附子多糖的保護(hù)效應(yīng)呈劑量依賴(lài)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，附子多糖可以保護(hù)心肌細(xì)胞對(duì)抗缺氧復(fù)氧損傷，其作用機(jī)制與附子多糖抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，阻礙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。但附子多糖通過(guò)哪些通路作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，還有待于進(jìn)一步的研究。

[1] 殷 然,王夢(mèng)洪,鄭澤琪，等.肝X受體抑制乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷[J].中國(guó)病理生理雜志，2011，27(9)：1671-1675.

[2] Marciniak S，Ron D. Endoplasmic reticulum stress signaling in disease[J]. Physiol Rev，2006，86(4)：1133-1149.

[3] 劉古峰，吳偉康，段新芬. 附子多糖對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)小鼠自由基代謝的影響[J]．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2008,37(5)：529-532.

[4] Zhao C,Li M ,Luo Y, et al. Isolation and structural characterization of an immunostimulating polysaccharide from Fuzi,Aconitumcarmichaeli[J]. Carbohydr Res, 2006, 341(4):485-491.

[5] Rutkowski DT,Kaufman RJ.A trip to the ER: coping with stress [J]. Trends Cell Biol,2004, 14(1):20-28.

[6] Boyce M，Yuan J. Cellular response to endoplasmic reticulum stress：a matter of life or death[J]. Cell Death Differ, 2006, 13(3):363-373.

[7] Glembotski CC. The role of the unfolded protein response in the heart [J]. J Mol Cell Cardiol, 2008, 44(3):453-459.

[8] Qi X, Vallentin A, Churchill E, et al.δPKC participates in the endoplasmic reticulum stress-induced response in cultured cardiac myocytes and ischemic heart[J]. J Mol Cell Cardiol, 2007, 43(4):420-428.

[9] Zhang GG, Teng X, Liu Y, et al. Inhibition of endoplasm reticulum stress by ghrelin protects against ischemia/reperfusion injury in rat heart[J]. Peptides, 2009, 30(6):1109-1116.

[10] Miyazaki Y, Kaikita K, Endo M, et al. C/EBP homologous protein deficiency attenuates myocardial reperfusion injury by inhibiting myocardial apoptosis and inflammation[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2011, 31(5):1124-1132.

Fuzipolysaccharideprotectsneonatalratcardiomyocyteswithhypoxia-reoxygenationbyinhibitingendoplasmicreticulumstress

LIU Ying1, JI Chao1, WU Wei-kang2

(1DepartmentofPathophysiology,SchoolofBasicCourses,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510224,China;2InstituteofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,SunYet-senUniversity,Guangzhou510089,China.E-mail: 13322819916@163.com)

AIM: To investigate whether the protection mechanism of Fuzi polysaccharide (FPS) is related to inhibition of endoplasmic reticulum stress in cultured neonatal rat cardiomyocytes with hypoxia/reoxygenation (H/R).METHODSCultured rat myocardial cells were divided into control group, H/R group (hypoxia for 3 h and reoxygenation for 6 h) and different concentrations of FPS (0.1 g/L, 1 g/L, 10 g/L or 20 g/L) +H/R groups. The cell survival was detected by MTT assay and cell apoptosis of cardiomyocytes was measured by flow cytometry using Annexin V-FITC staining. The expression of glucose-regulated protein 78 (GRP78), CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein (CHOP) and caspase-12 were determined by Western blotting. The mRNA expression of CHOP and caspase-12 was detected by quantitative PCR.RESULTSAfter reoxygenation, the expression of GRP78, CHOP and caspase-12 in cardiomyocytes was increased. Compared with H/R group, the expression of GRP78, CHOP and caspase-12 in FPS+H/R groups was significantly inhibited, the survival rate of cardiomyocytes was increased and the apoptosis of cardiomyocytes was inhibited. This protective effect of FPS was in a dose-dependent manner and reached its peak at 10 g/L.CONCLUSIONFuzi polysaccharide protects cardiomyocytes from H/R injury. The mechanism is related to inhibiting endoplasmic reticulum stress.

Fuzi polysaccharide; Endoplasmic reticulum stress; Hypoxia/reoxygenation injury; Cardiomyocytes

R541.6

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.013