劉 文，陳文秋，潘 健，余敏靈

(四川省樂山市食品藥品檢驗所，四川 樂山 614000)

天花粉為葫蘆科植物栝樓 Trichosantheskirilowii Maxim.的干燥根，收載于2010年版《中國藥典(一部)》[1]，是一種富含氨基酸的中藥材[2]。其所含的瓜氨酸在人體的氨基酸、蛋白質(zhì)代謝中有較重要的作用;γ-氨基丁酸也具有多種生理作用，如臨時性降壓作用，對胰腺癌細(xì)胞SW1990細(xì)胞的生長及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響，以及作為哺乳動物攝食和味覺的調(diào)控因子等[3-5]。因此，測定天花粉中的瓜氨酸與γ-氨基丁酸含量對于評價其質(zhì)量有一定的意義，但尚未見有同時測定天花粉中兩組分含量的相關(guān)文獻(xiàn)。為此，筆者采用了柱前衍生反相高效液相色譜(RP-HPLC)法對天花粉中瓜氨酸與γ-氨基丁酸含量進(jìn)行了同時測定，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

美國Waters2695型高效液相色譜儀，包括2487型紫外檢測器，Empower色譜工作站;美國Varian Cary100型紫外可見分光光度計。瓜氨酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為875-200003);γ-氨基丁酸(成都市科龍化工試劑廠，批號為20021101);異硫氰酸苯酯(北京北分瑞利＜集團(tuán)＞有限公司，批號為AAD06001);乙腈(上海陸都化學(xué)試劑廠，色譜純);其余試劑均為分析純;天花粉(樂山康發(fā)藥業(yè)股份有限公司，批號為1000302，1000509，1000706)，按 2005 年版《中國藥典(一部)》鑒定，植物來源為葫蘆科植物栝樓 Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

精密稱取瓜氨酸對照品186.0 mg，γ-氨基丁酸對照品515.2 mg，分置兩個200 mL量瓶中，加鹽酸溶液(0.1 mol/L)適量使溶解后，加鹽酸溶液至刻度，搖勻，作為瓜氨酸對照品貯備液和γ-氨基丁酸對照品貯備液;精密量取上述貯備液各10 mL，置100 mL量瓶中，加鹽酸溶液(0.1 mol/L)稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。取天花粉(批號為1000302)適量粉碎后，混勻，精密稱取3.0618g，置具塞錐形瓶中，分別加80%的甲醇溶液100，100，50，50 mL，提取4次，每次60℃超聲振搖20 min，合并甲醇溶液，水浴蒸干，殘渣用鹽酸溶液(0.1 mol/L)溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用鹽酸溶液(0.1 mol/L)稀釋至刻度，搖勻，作為供試品貯備液。

2.2 樣品衍生化

精密量取供試品貯備液適量(10～400μL)，置1 mL量瓶中，加異硫氰酸苯酯-乙腈溶液(25μL∶2 mL)200μL，加三乙胺-乙腈溶液(1.4∶8.6)稀釋至刻度，搖勻，放置1 h，轉(zhuǎn)移至試管中，加正己烷1 mL，振搖，分取下層液體，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 檢測波長選擇

取對照品貯備液100μL，按2.2項下方法衍生化后，取續(xù)濾液于200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果該溶液在248 nm波長處有最大吸收，故選擇248 nm作為檢測波長。

2.4 色譜條件

色譜柱:Venusil-AA氨基酸分析柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:A為0.05 mol/L醋酸鈉溶液(pH=6.5)，B為乙腈-水(80∶20)梯度洗脫(見表1);流速:1.00 mL/min;檢測波長:248 nm;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:10μL。

表1 流動相梯度洗脫表

2.5 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗:分別取供試品貯備液100μL和對照品貯備液100μL，按2.2項下方法衍生化后，取續(xù)濾液照2.4項下色譜條件分別進(jìn)樣，色譜圖見圖1。供試品溶液色譜圖中，有與對照品溶液色譜圖中瓜氨酸與γ-氨基丁酸色譜峰相對應(yīng)的色譜峰，且與其他色譜峰有較好的分離度，分離度大于1.5，理論板數(shù)均大于3 000。另取鹽酸溶液(0.1 mol/L)100μL，按2.2項下方法衍生化后，濾過，作為空白對照溶液，照2.4項下色譜條件分別進(jìn)樣，結(jié)果空白對照溶液無相應(yīng)色譜峰。

線性關(guān)系考察:精密量取對照品貯備液10，100，200，300，400μL分別置1 mL量瓶中，按2.2項下方法衍生化后，取續(xù)濾液，照2.4項下色譜條件測定。以氨基酸質(zhì)量濃度(C，μg/mL)與色譜峰面積(A)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程瓜氨酸 A=70 367 C-121.8，r=0.999 7(n=5);γ-氨基丁酸 A=54 316 C-92.7，r=0.999 6(n=5)。結(jié)果表明，瓜氨酸與γ-氨基丁酸的進(jìn)樣量分別在9.30～372.00 ng與25.76～1 030.40 ng范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗:精密量取對照品貯備液100μL，按2.2項下方法衍生化后，取續(xù)濾液，照2.4項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果瓜氨酸與γ-氨基丁酸色譜峰面積平均值分別為654 410和1 399 020，RSD分別為1.5%和1.2%(n=5)，表明方法的精密度良好。

重復(fù)性試驗:精密量取供試品貯備液100μL共6份，分別置6個1 mL量瓶中，按2.2項下方法衍生化后，取續(xù)濾液，照2.4項下色譜條件測定。結(jié)果瓜氨酸與γ-氨基丁酸色譜峰面積平均值分別為1 443 979和238 122，RSD分別為1.6%和1.0%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗:取2.1項下供試品貯備液100μL，按2.2項下方法衍生化后，取續(xù)濾液，照2.4項下色譜條件分別于0，1，2，6，12 h時進(jìn)樣，測定峰面積。結(jié)果瓜氨酸與γ-氨基丁酸峰面積的RSD分別為1.6%與1.2%(n=5)，表明被測溶液在室溫條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定，能滿足含量測定要求。

加樣回收試驗:取已知含量的天花粉(批號為1000302)適量粉碎后，混勻，精密稱取細(xì)粉9份(每份約1.5 g)，分別置9個具塞錐形瓶中，精密加入瓜氨酸對照品貯備液 4.4，4.4，4.4，5.5，5.5，5.5，6.6，6.6，6.6 mL 和 γ -氨基丁酸貯備液 0.33，0.33，0.33，0.41，0.41，0.41，0.49，0.49，0.49 mL，照供試品貯備液制備方法制備溶液，濾過，取續(xù)濾液100μL，按2.2項下方法衍生化后，取續(xù)濾液，照2.4項下色譜條件測定，計算含量和加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

2.6 樣品含量測定

取天花粉適量，粉碎后，混勻，稱取粉末約3 g，精密稱定，按2.1項下操作方法制得天花粉提取液;精密量取天花粉提取液100μL，置1 mL量瓶中，按2.2項下方法衍生化后，取續(xù)濾液，照2.4項下色譜條件測定，計算樣品含量。結(jié)果見表3。

3 討論

在試驗中加入正己烷的目的是，除去中藥材提取和衍生化反應(yīng)后被測溶液中的脂溶性物質(zhì)。該方法測定溶液穩(wěn)定性好，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)被測物質(zhì)有較好的線性關(guān)系，可作為天花粉中瓜氨酸與γ-氨基丁酸的含量測定方法。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:1.

表3 樣品含量測定結(jié)果

[2]徐國均.生藥學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1987:409.

[3]陳瓊?cè)A.生物化學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1991:283.

[4]王 營，劉 偉，余勝利，等.γ-氨基丁酸對胰腺癌細(xì)胞SW1990細(xì)胞的生長及VEGF的表達(dá)的影響[J].山東醫(yī)藥，2006，46(31):3-4.

[5]雷 奇，閆劍群，施京紅，等.GABA在攝食和味覺機制中的作用[J].世界華人消化雜志，2006，14(19):1 906-1 911.