李 勇，姚 曦

(廣東藥學(xué)院藥物研究所·廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東 廣州 510006)

佛手(Bergamot)為蕓香科(Rutaceae)柑橘屬植物佛手 Cirtus medica L.var.Sarcodactylis(noot.)Swingle的干燥果實，主產(chǎn)于閩、粵、川、江、浙等省，為“十大廣藥”之一，具有舒肝理氣、和胃止痛功效。佛手主要含黃酮類、多糖、香豆素類等成分，尚含有胡蘿卜素、琥珀酸等[1-3]。佛手傳統(tǒng)炮制方法主要采用蒸制，市場上佛手飲片常見蒸制品、清炒品。目前筆者尚未見炮制對佛手成分影響的文獻報道。本研究中對佛手不同炮制品中的多糖類成分含量進行測定，以其為佛手的深入研究提供試驗支持，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

UV-1101型分光光度計(上海天美科技儀器有限公司);BS-224S型電子天平(賽多利斯);移液槍(德國)。佛手、制佛手(批號為20091201，廣州致信藥業(yè)有限公司);蘆丁對照品(批號為100080-200306)、葡萄糖對照品(批號為110833-200302)，購自中國藥品生物制品檢定所;濃硫酸、苯酚等試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材炮制

制佛手:取生佛手250 g，蒸1 h即得。

炒佛手:取生佛手250 g，大小分檔，置干鍋內(nèi)文火炒至佛手表面呈黃色，即得。

微波制:取生佛手50 g，分別采用微波加熱(輸出功率700 w)90，120，180 s，每組平行 6 份，即得。

2.2 樣品制備(用于總多糖含量測定)

水提取[4]:分別取生佛手、制佛手、炒佛手、微波制(90，120，180 s)樣品各50 g，分別置1 000 mL圓底燒瓶中，加水回流提取兩次(10倍量水、8倍量水)，每次1.5 h，提取液過200目濾布，合并提取液，減壓濃縮，定容至250 mL量瓶中，作為供試品溶液。

醇提取[5]:分別取生佛手、制佛手、炒佛手、微波制(90，120，180 s)樣品各50 g，分別置1 000 mL圓底燒瓶中，加50%乙醇回流提取2次(10倍量、8倍量)，每次1.5 h，提取液過200目濾布，合并提取液，減壓回收乙醇，定容至250 mL量瓶中，作為供試品溶液。

2.3 含量測定[6]

2.3.1 對照品溶液制備

精密稱取葡萄糖對照品20.01 mg，置250 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.3.2 測定波長選擇

精密量取對照品溶液1 mL、供試品溶液0.1 mL，分別加水補至2 mL，分別加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，再加入濃硫酸5.0 mL，迅速振搖混勻，沸水浴15 min，取出放至室溫，加水定容至10 mL，搖勻。按紫外分光光度法，在200～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，掃描波譜圖見圖1和圖2。最終選用490 nm作為測定波長。

圖1 葡萄糖光譜圖

圖2 佛手多糖光譜圖

2.3.3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:分別吸取對照品溶液 0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL，按 2.3.2 項下自“加水補至 2.0 mL”起操作，在490 nm波長處測定吸光度，以2.0 mL的水按照同樣方法顯色操作為空白，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光值(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 Y=0.047 X+0.009，r=0.998 2(n=8)，結(jié)果表明線性關(guān)系較好。

穩(wěn)定性試驗:精密移取2.2項下佛手水提取液1 mL，加水稀釋到250 mL，取1 mL，按照2.3.2項下自“加水補至2.0 mL”起操作，分別在 0，15，30，45，60 min 時測定其吸光度。結(jié)果吸光度平均值為0.365，RSD為1.36%，說明供試品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:精密移取2.2項下佛手水提取液1 mL，加水稀釋到250 mL，取1 mL，平行6份，按照2.3.2項下自“加水補至2.0 mL”起操作，依法測定吸光度，計算總多糖含量。結(jié)果佛手中總多糖平均含量為46.52 mg/g，RSD=2.29%(n=6)。

回收率試驗:精密移取2.2項下佛手水提取溶液1 mL，加水稀釋到250 mL，取1 mL，共9份，精密加入葡萄糖對照品溶液0.186，0.233，0.280 mL(質(zhì)量濃度 80.04 μg/mL)，按供試品溶液制備方法制備溶液，測定多糖含量，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 多糖加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

2.3.4 樣品含量測定

精密移取2.2項下供試品溶液各1 mL，加水稀釋到250 mL，取1 mL，按照2.3.2項下操作測定吸光度，按回歸方程求出供試液中葡萄糖含量，計算樣品中多糖含量。結(jié)果見表2。試驗結(jié)果表明用水提取，總多糖含量優(yōu)于用50%乙醇提取，不同炮制方法對總多糖含量基本無影響，總多糖含量隨微波加熱時間增加而降低。

表2 樣品總多糖含量測定結(jié)果(mg/g)

3 討論

苯酚-硫酸法是測定多糖含量的常用方法之一，具有簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點。在試驗中發(fā)現(xiàn)，該法中苯酚和濃硫酸的比例十分關(guān)鍵，濃硫酸加入量不足，會使多糖水解不完全，單糖不能充分釋出;但加入量也不能過多，過多濃硫酸會使釋出的單糖或衍生物部分被破壞，影響含量測定，須控制為1∶5，同時應(yīng)保證溶液中硫酸的濃度。硫酸的加入方法不同對顯色結(jié)果也有影響，故在操作過程中盡量保持一致。

微波穿透力強，藥物在加熱過程中吸收微波能量，使極性分子發(fā)生旋轉(zhuǎn)運動，分子間互相磨擦而生熱，從而使水分汽化產(chǎn)生的壓力將細胞膜和細胞壁沖破，形成微小的孔洞或裂縫，藥物質(zhì)地酥脆而達到炮制的目的。微波炮制佛手藥材，色澤均勻、微黃，可達到炒黃的標(biāo)準(zhǔn)，不但溫度和時間可控，而且操作簡便。但當(dāng)加熱超過90 s時，藥材出現(xiàn)部分炭化，是導(dǎo)致多糖成分損失的主要原因，應(yīng)嚴(yán)格控制微波加熱時間。

[1]尹 鋒，成 亮，樓鳳昌.佛手化學(xué)成分的研究[J].中國藥學(xué)雜志，2004，2(3):149-151.

[2]李小鳳，蔡 春，程荷鳳，等.廣佛手多糖的分離純化與相關(guān)成分的氣相色譜分析[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，23(3):240-241.

[3]崔紅花，高幼衡，蔡鴻飛，等.主成分分析對佛手最佳產(chǎn)地的探討[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，26(3):281-283.

[4]王 琴，蔣 林，張爵玉.廣佛手多糖分離提取的工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2008，29(4):199-201.

[5]姜立春，黃成思，楊澈川，等.佛手總黃酮提取及抗氧化性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(3):340-342.

[6]鄒士玉，馬方勵，丁 博.苯酚-硫酸法測定“潤和津露”的粗多糖含量[J]. 中藥材，2007，30(11):1 470-1 472.