林凡 王敏 洪曉泉 周偉 王欣 秦仁義

·短篇論著·

miR-146b-5p異常表達對胰腺癌細胞生物學特性的影響

林凡 王敏 洪曉泉 周偉 王欣 秦仁義

MicroRNAs(miRNAs) 是由一類內(nèi)源性的非編碼RNA組成，長度大約20～24 nt，來源于長的前體pri-miRNA和pre-miRNA[1-3]。在多細胞生物體中，它通過不完全堿基互補配對的方式識別靶位點，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達[4-5]。盡管過去的幾年中通過基因芯片篩查腫瘤特異性miRNA有很大的進展[6]，但miRNA影響腫瘤形成和發(fā)展的機制仍不清楚。本研究檢測6株胰腺癌細胞miR-146b-5p的表達，觀察其對胰腺癌細胞生物學特性的影響。

一、材料與方法

1．細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：人胰腺癌細胞系MIA PaCa-2、BxPC-3、AsPC-1、PANC1、SW1990、PC-3為同濟醫(yī)院膽胰外科實驗室保存，3例正常胰腺組織為膽管腫瘤行胰十二指腸切除術(shù)的手術(shù)標本。取對數(shù)生長期miR-146b-5p表達最低的MIA PaCa-2細胞，采用lipofectamineTM2000將miR-146b-5p mimics和陰性對照miRNA(廣州銳博公司)分別轉(zhuǎn)染細胞，按照lipo2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作。

2．qRT-PCR檢測miR-146b-5p的表達：應(yīng)用Trizol(Invitrogen公司)提取細胞或組織中的總RNA。分光光度計(Eppendorf BioPhotometer)測RNA的純度和濃度。應(yīng)用ReverTra Ace?qPCR RT Kit(FSQ-101，TOYOBO公司) 二步法合成cDNA。應(yīng)用SYBR?Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO公司)行實時熒光定量PCR。miR-146b-5p莖環(huán)狀逆轉(zhuǎn)錄引物，上、下游引物和內(nèi)參RNA U6引物均購自廣州銳博公司。PCR反應(yīng)條件：95℃ 3 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min,40次循環(huán)。獲得的數(shù)據(jù)運用公式RQ=2-△△Ct的方法計算mRNA表達量。實驗重復3次，取均值。

3．MTT法檢測細胞增殖：直接在96孔板轉(zhuǎn)染細胞，24、36、48、60、72 h時分別每孔加入20 μl MTT(5 g/L，Sigma公司)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去液體，加入150 μl DMSO，震蕩10 min，酶標儀測定各孔490 nm 處的吸光值(A490值)。每個時間點設(shè)5個復孔，實驗重復3次，取均值。

4．流式細胞儀檢測細胞凋亡率和細胞周期：取轉(zhuǎn)染48 h細胞，消化后用預冷的PBS洗2次，部分細胞用500 μl Binding Buffer 重懸細胞于流式管中，加入5 μl Annexin Ⅴ/FITC(南京凱基公司)，再加入5 μl PI，混勻后室溫避光15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率；部分細胞用PBS重懸，加入兩倍體積在-20℃預冷的70%乙醇4℃固定過夜。PBS洗滌2次后加100 μl RNase A，37℃水浴 30 min，再加入400 μl PI混勻，4℃避光30 min，上機檢測細胞周期。實驗重復3次，取均值。

5．細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力：MIA PaCa-2細胞轉(zhuǎn)染48 h后，用100 μl的消毒槍頭進行人工劃痕，用無血清培養(yǎng)液洗滌2次去除細胞碎片，倒置顯微鏡下(Nikon，日本)測量劃痕區(qū)相對距離。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，新鮮培養(yǎng)基洗滌2次，鏡下觀察細胞向劃痕區(qū)遷移的數(shù)目。每組設(shè)3個平行孔，每孔隨機選取3個視野進行細胞計數(shù)。

6．Transwell小室侵襲實驗檢測細胞侵襲能力：應(yīng)用基質(zhì)膠包被Transwell小室(Corning公司)微孔膜。上室加入用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸的轉(zhuǎn)染48 h的MIA PaCa-2細胞200 μl(含10萬個細胞)，下室內(nèi)加入600 μl含20% FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后吸去室內(nèi)液體，用棉棒擦去微孔膜上室面的細胞，甲醛固定15 min，PBS洗2遍后晾干，5 μg/ml DAPI(上海碧云天公司)染色30 min，PBS洗2遍，熒光顯微鏡下隨機選取3個視野計穿膜細胞數(shù)。實驗做3個小室，取均值。

二、結(jié)果

1．6株胰腺癌細胞的miR-146b-5p表達：以3例正常胰腺組織miR-146b-5p的表達均值為對照，U6為內(nèi)參， MIA PaCa-2、BxPC-3、AsPC-1、PANC1、SW1990和PC-3細胞miR-146b-5p表達量均低于正常胰腺組織，其中以MIA PaCa-2細胞表達最低(圖1)。

2．轉(zhuǎn)染后MIA PaCa-2細胞的miR-146b-5p表達：轉(zhuǎn)染48 h后，MIA PaCa-2細胞miR-146b-5p表達量較對照組細胞升高306.5倍。

3．細胞增殖變化：轉(zhuǎn)染 miR-146b-5p的MIA PaCa-2細胞與對照組細胞的生長曲線幾乎一致，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖2)。

4．細胞周期及凋亡率的變化：轉(zhuǎn)染 miR-146b-5p與對照組MIA PaCa-2細胞的凋亡率和細胞周期差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表 1)。

5．細胞遷移和侵襲力的變化：轉(zhuǎn)染miR-146b-5p組MIA PaCa-2細胞的遷移細胞為(36±4 )個，細胞穿膜數(shù)為(35±3)個，均較對照組的(165±10)個及(140±9)個顯著減少(圖3；t=79.00、19.17，P<0.05)。

圖1 正常胰腺組織及6株胰腺癌細胞的miR-146b-5p表達

圖2 轉(zhuǎn)染組與對照組MIA PaCa-2細胞的生長曲線

表1 兩組的細胞凋亡率和細胞周期

圖3轉(zhuǎn)染組(a)與對照組(b)MIA PaCa-2細胞的遷移(上)和穿膜細胞(下)

討論近年來一類長度約為22nt的miRNAs受到了人們的廣泛關(guān)注，它是一種廣泛存在的對基因進行微調(diào)的分子，約占人類基因組的1%。miRNAs不直接編碼蛋白，其與目的基因結(jié)合降解mRNA和(或)抑制其翻譯，對細胞的分化、增殖和凋亡等起著極為重要的調(diào)控作用[7]。研究表明，miRNAs和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，多個miRNA被證實為癌基因和抑癌基因[8]。

Taganov等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-146通過負反饋調(diào)節(jié)降低IL-1受體相關(guān)激酶1、TNF受體相關(guān)因子6蛋白水平而抑制天然免疫反應(yīng)。Hurst等[10]證實，乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制因子1(BRMS1)上調(diào)miR-146，從而抑制乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移。Xia等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-146b 通過靶向基質(zhì)金屬蛋白酶抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲。之前我們應(yīng)用miRNAs 芯片技術(shù)比較了胰腺癌干細胞(CD24+CD44+ESA+)與非干細胞miRNAs表達譜的差異，發(fā)現(xiàn)miR-146b-5p在胰腺癌干細胞中的表達顯著降低。本研究應(yīng)用qRT-PCR檢測了6株胰腺癌細胞中miR-146b-5p的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6株胰腺癌細胞miR-146b-5p表達均較正常胰腺組織下調(diào)，以MIA PaCa-2細胞的表達最低。

為了明確miR-146b-5p對胰腺癌生物學特性的影響，本研究將miR-146b-5p mimics轉(zhuǎn)染MIA PaCa-2細胞。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-146b-5p mimics后，MIA PaCa-2細胞miR-146b-5p表達水平顯著升高，細胞增殖能力、細胞凋亡率、細胞周期無明顯改變，但細胞遷移和侵襲能力明顯降低，表明miR-146b-5p可能對胰腺癌細胞的遷移和侵襲有調(diào)控作用。但是miRNAs的作用是協(xié)同的，網(wǎng)絡(luò)式的，將某一個miRNA挑出來研究可能會孤立地片面的看問題。miR-146b-5p不是胰腺癌中惟一異常表達的小RNA分子，所以應(yīng)該找出更多異常表達的小RNA分子，發(fā)現(xiàn)它們之間的聯(lián)系，以便更好地理解胰腺癌的發(fā)生機制。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.020

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430030 武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院膽胰外科

秦仁義，Email:ryqin@tjh.tjmu.edu.cn

2011-03-03)

(本文編輯：呂芳萍)