劉偉平 殷明剛 阮艷秋

目前HBV感染者約有3．5億人，成為威脅人類健康的全球性問題之一，其持續(xù)感染可致嚴(yán)重的肝損傷，并可能進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化和肝癌［1］。乙肝的康復(fù)或進(jìn)展過程中，有賴于體液和細(xì)胞免疫的協(xié)同作用［2］，可出現(xiàn) HBeAg向 HBeAb或 HBsAg向 HbsAb的血清學(xué)轉(zhuǎn)換。有文獻(xiàn)［3～5］報(bào)道了HBV感染患者血清中存在HBsAg與HBsAb共存的少見模式，而這些血清模式的病毒學(xué)意義、免疫反應(yīng)機(jī)制以及患者預(yù)后仍未完全弄清楚。HBV DNA定量檢測(cè)可反映患者體內(nèi)HBV DNA載量，反映人體感染HBV與否的可靠指標(biāo)［6］。為了解HBsAg和HBsAb共存血清模式的分布特點(diǎn)和病毒復(fù)制情況，以便更好指導(dǎo)臨床治療和監(jiān)測(cè)急、慢性乙型肝炎，我們對(duì)96例HBsAg和HB-sAb共存的血清模式樣本進(jìn)行了HBV DNA定量檢測(cè)，同時(shí)對(duì)HBV DNA熒光定量檢測(cè)在此模式中的臨床價(jià)值進(jìn)行了初步探討。

材料與方法

1．標(biāo)本來(lái)源:收集筆者醫(yī)院2008年8月1日～2010年8月1日門診和住院患者乙肝血清標(biāo)志物HBsAg和HBsAb檢測(cè)同時(shí)陽(yáng)性的標(biāo)本96例。其中男性54名，女性42名，患者年齡為43．7±15．2歲。所有兩者同時(shí)陽(yáng)性的標(biāo)本均通過重新抽血并用同一廠家ELISA法試劑和另一廠家的時(shí)間分辨熒光免疫分析法復(fù)查，確認(rèn)結(jié)果一致后作為入選對(duì)象。同時(shí)抽取約3m l血液加入無(wú)任何添加劑的無(wú)菌真空管中，待血液凝固后2h內(nèi)離心(1500r/min，5min)分離血清標(biāo)本，－70℃保存，所有標(biāo)本在同一條件下同時(shí)測(cè)定HBV DNA拷貝數(shù)。

2．方法:乙肝標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒購(gòu)自英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司，HBsAg、HBeAg檢測(cè)采用ELISA雙抗體夾心法，結(jié)果判定以S/CO≥1．0為陽(yáng)性;HBsAb檢測(cè)采用ELISA雙抗原夾心法，以 S/CO≥1．0為陽(yáng)性;HBeAb以及 HBcAb采用ELISA競(jìng)爭(zhēng)法，以S/CO＜1．0為陽(yáng)性;時(shí)間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)及配套的乙型肝炎兩對(duì)半檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海新波生物技術(shù)有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作和判讀結(jié)果。HBV－DNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)，病毒載量≥1．0×103拷貝/毫升判為陽(yáng)性。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:用SPSS 11．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，均值比較采用t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．乙肝血清標(biāo)志物HBsAg和HBsAb共存模式的分布情況:2008年8月1日～2010年8月1日共檢測(cè)乙肝血清標(biāo)志物29365例，其中乙肝表面抗原陽(yáng)性3054例，占10．4%;HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)性血清學(xué)模式96例，占乙肝表面抗原陽(yáng)性模式的3．1%(96/3054)。HBsAg和HBsAb共存的模式分布情況如表 1 所示，“1，2，3，5”陽(yáng)性模式組最多見，占53.1%(51/96)，“1，2，4，5”陽(yáng)性模式組次之，占35.4%(34/96)。

表1 HBsAg和HBsAb共存模式的分布情況

2．HBsAg和HBsAb共存模式與HBV DNA病毒載量的關(guān)系:在96例HBsAg和HBsAb共存的血清標(biāo)本中，HBV DNA陽(yáng)性的例數(shù)為70例，占73%(70/96)。按HBeAg是否為陽(yáng)性，人為分為兩組，比較兩者HBV DNA的陽(yáng)性率和病毒載量。結(jié)果如表2所示，兩組間HBV DNA的陽(yáng)性率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12．096，P ＜ 0．05)，且 HBeAg 陽(yáng)性組高于HBeAg陰性組;HBV DNA病毒載量亦為HBeAg陽(yáng)性組高于HBeAg陰性組(P＜0．05)。

表2 HBsAg和HBsAb共存模式的HBV DNA檢測(cè)結(jié)果

3．不同S/CO范圍的HBsAg和HBsAb共存模式與HBV DNA陽(yáng)性率的關(guān)系:根據(jù)HBsAg和HBsAb的吸光度與Cut Off比值(S/CO)的相對(duì)高低，人為分為A、B、C、D 共 4 組，A 組為 HBsAg(S/CO 1．0 ～1.9)，HBsAb(S/CO≥2);B組為 HBsAg(S/CO≥2)，HBsAb(S/CO≥2);C組為HBsAg(S/CO≥2)，HBsAb(S/CO 1．0 ～1．9);D 組為 HBsAg(S/CO 1．0 ～1．9)，HBsAb(S/CO 1．0～1．9)。結(jié)果如表3所示，在 HB-sAg和HBsAb共存模式中，HBV DNA總陽(yáng)性率為72．9%(70/96)。C組 HBV DNA陽(yáng)性率最高，占61.5%(59/96)，其他組陽(yáng)性率由高到低依次為B、A、D組。

表3 不同S/CO范圍的HBsAg和HBsAb共存模式的HBV DNA陽(yáng)性率

討 論

由于人體感染乙肝病毒后機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答，HBsAg與HBsAb處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，從理論上來(lái)說，HBsAg和HbsAb通常不會(huì)同時(shí)存在于同一個(gè)體的血清中［7］。但是越來(lái)越多的臨床檢測(cè)結(jié)果并不支持這一觀點(diǎn)。據(jù)謝士達(dá)等［8］報(bào)道HBsAg與HBsAb同時(shí)檢出的病例約占全部乙肝血清標(biāo)志物送檢標(biāo)本的0．25%，在乙肝患者中約為5%;又如王蕾等和Zhang等［9，10］分別報(bào)道 HBsAg 與 HBsAb 同時(shí)陽(yáng)性的樣本占HBsAg陽(yáng)性樣本的4．08%和4．9%。本調(diào)查結(jié)果顯示，HBsAg與HBsAb共存模式占HBsAg陽(yáng)性模式的3．1%(96/3054)。其中無(wú)癥狀乙肝攜帶者占7.2%(7/96)，慢性乙型肝炎占 61．4%(59/96)，急性重型肝炎占10．4%(10/96)，肝硬化占11．6%(11/96)，肝癌占9．4%(9/96)。不同文獻(xiàn)報(bào)道存在一定差異的可能原因有:①乙肝感染率在各地區(qū)存在一定的差異，治療方法也不完全相同，可導(dǎo)致乙肝基因變異率存在差異性;②ELISA檢測(cè)乙肝血清標(biāo)志物的影響因素較多，而且方法本身也存在一定局限性，故產(chǎn)生一些假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。此外，不同實(shí)驗(yàn)室所選用的廠家試劑方法的靈敏度和準(zhǔn)確度不完全相同，也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果存在差異性。因此，對(duì)ELISA法檢測(cè)出“矛盾”模式的結(jié)果，應(yīng)該進(jìn)一步使用靈敏度和準(zhǔn)確度更高的時(shí)間分辨免疫分析法或化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行復(fù)查，以提高結(jié)果的可靠性;③檢驗(yàn)技術(shù)人員自身的素質(zhì)和水平也會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

HBsAg和HBsAb共存的現(xiàn)象，具體原因和機(jī)制復(fù)雜多樣。目前認(rèn)為，主要有以下幾個(gè)方面原因:①某些個(gè)體注射乙肝疫苗后，正常應(yīng)答產(chǎn)生的HBsAb不能與由于前S/S區(qū)基因變異后產(chǎn)生的HBsAg結(jié)合，在這種情況下兩者可同時(shí)共存而被檢測(cè)出來(lái);②不同亞型的HBV先后重疊感染［11］;③藥物治療的影響:如干擾素治療乙肝雖然可使部分個(gè)體出現(xiàn)HBsAg和HBsAb發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換，但不能清除S區(qū)基因變異后產(chǎn)生的HBsAg。拉米夫定抗病毒治療可使HBV P區(qū)基因發(fā)生變異，導(dǎo)致HBV突變株產(chǎn)生的HBsAg與HBsAb的結(jié)合能力變?nèi)?④部分乙肝患者曾注射高效價(jià)乙肝免疫球蛋白，導(dǎo)致血清HBsAb與HBsAg共存;⑤在病毒感染后人體免疫系統(tǒng)反應(yīng)的過程中，乙型肝炎病毒可整合入人體染色體，使得體內(nèi)表面抗原的存在與表面抗體的產(chǎn)生可能同時(shí)出現(xiàn);⑥HBsAg和HbsAb共存與HBsAg主要親水區(qū)(MHR)的氨基酸變異有關(guān)，特別是與“a”抗原決定族的氨基酸發(fā)生變異有關(guān)［14］;⑦某些乙肝患者體內(nèi)存在不同基因組的HBV，編碼產(chǎn)生的HBsAg結(jié)構(gòu)不同，形成的抗原－抗體循環(huán)免疫復(fù)合物可較長(zhǎng)時(shí)間存在于患者體內(nèi)而被檢測(cè)出來(lái)［11］。

本結(jié)果表明，HBsAg與HBsAb共存模式的血清標(biāo)本HBV DNA陽(yáng)性率較高(72．9%)，且在所有共存模式中，HBeAg陽(yáng)性的模式組HBV DNA陽(yáng)性率高達(dá)86%，顯著高于HBeAg陰性的模式組。此外，HBeAg陽(yáng)性的模式組HBV DNA的平均病毒載量處于105數(shù)量級(jí)的較高水平狀態(tài)，而HBeAg陰性的模式組HBV DNA的平均病毒載量在104數(shù)量級(jí)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HBsAg效價(jià)高于HBsAb的患者組(C組)血清HBV DNA的陽(yáng)性率高于其余各組，為61．5%(59/96)。這說明HBsAg與HBsAb共存模式患者血清的HBV DNA的陽(yáng)性率主要取決于HBsAg的效價(jià)，且與HBsAg和HBsAb的相對(duì)強(qiáng)弱有關(guān)。因此，臨床上乙肝治療和監(jiān)測(cè)過程中，若患者出現(xiàn)HBsAb與HBsAg共存模式，往往并非預(yù)示乙肝病毒的清除或疾病恢復(fù)狀態(tài)，可通過熒光定量PCR檢測(cè)血清HBV DNA確定體內(nèi)病毒是否復(fù)制和載量高低，提示臨床醫(yī)生對(duì)治療方案進(jìn)行必要的調(diào)整。

1 Lavanchy D．Hepatitis B virus epidemiology，diseaseburden，treatment，and currentand emerging prevention and controlmeasures［J］．JViral Hepat，2004，11(2):97 －107

2 Rehermann B，Nascimbeni M．Immunology of hepatitis B virus and hepatitisC virus infection［J］．Nat Rev Immunol，2005，5(3):215－229

3 Lu HY，Zeng Z，Xu XY，et al．Mutations in surface and polymerase gene of chronic hepatitis B patientswith coexisting HBsAg and anti－HBs［J］．World JGastroenterol，2006，12(26):4219 － 4223

4 Colson P，Borentain P，Motte A，etal．Clinicaland virological significance of the co－existence of HBsAg and anti－HBs antibodies in hepatitis B chronic carriers［J］．Virology，2007，367(1):30 － 40

5 Zhang Z，Li L，Tian Y，et al．HBsAg/HBsAb double positive hepatitis B virus infection model in vitro and in vivo［J］．JHuazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2009，29(5):575 － 579

6 劉偉平，殷明剛，馬盛余．HBV血清標(biāo)志物與Pre－S1抗原及HBV DNA 聯(lián)合檢測(cè)研究［J］．醫(yī)學(xué)研究雜志，2010，39(3):121－123

7 Peng Yin．乙型肝炎病毒編碼HBsAg區(qū)基因突變對(duì)免疫檢測(cè)的影響［J］．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005，28(7):687－690

8 謝士達(dá)，劉成永，王偉民，等．抗－HBs和HBsAg共存的不同模式對(duì)乙型肝炎病毒感染的影響［J］．胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2006，15(3):244－248

9 王蕾，劉華，章勵(lì)，等．乙型肝炎血清標(biāo)志物HBsAg和HBsAb同時(shí)陽(yáng)性模式的相關(guān)研究［J］．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2008，23(5):530 －534

10 Zhang JM，Xu Y，Wang XY，etal．Coexistence of hepatitis B surface antigen(HBsAg)and heterologous subtype－specific antibodies to HBsAg among patients with chronic hepatitis B［J］．Clin Infect Dis，2007，44(9):1161－1169

11 Zhang ZH，Li L，Zhao XP，etal．Elimination ofhepatitis B virus surface antigen and appearance of neutralizing antibodies in chronically infected patients without viral clearance［J］．JViral Hepat，2011，18(6):424－433