黃柳桓，張亞南，康熙雄

（1.首都醫(yī)科大學(xué)石景山教學(xué)醫(yī)院·北京市石景山醫(yī)院 胸外科，北京100043；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院 檢驗科，北京100050）

心臟疾病諸如心肌梗死、慢性心衰和心肌肥大與心肌細胞的細胞偶聯(lián)改變相關(guān)?？p隙連接蛋白43（Connexin 43，Cx43）是心室電偶聯(lián)的主要蛋白，動物試驗證明Cx43基因突變小鼠雖然有正常心臟結(jié)構(gòu)和收縮功能，但2個月內(nèi)容易因自發(fā)性室性心律失常而死于心源性猝死［1］。缺血／再灌注損傷機制的研究發(fā)現(xiàn)因缺血誘導(dǎo)的細胞脫偶聯(lián)和Cx43去磷酸化，使Cx43從縫隙連接轉(zhuǎn)移進入細胞池而改變細胞間通訊信號［2，3］。Cx43含量、分布及其磷酸化的改變和異常表達導(dǎo)致心肌細胞功能阻滯，形成陣發(fā)性室性心動過速［4］。

乙酰膽堿（ACh）是內(nèi)皮依賴性血管擴張劑，藥理作用是模擬缺血預(yù)處理，使心臟在隨后出現(xiàn)的缺血環(huán)境下抵御梗死、預(yù)防梗死、防止冠狀動脈阻塞或心臟病發(fā)作［5］。ACh通過上調(diào) TNF receptor－2和下調(diào) TNF receptor－1［6］、抑制缺氧誘發(fā)細胞凋亡［7］抵御缺血等多種途徑保護心臟，然而在缺氧條件下ACh增加Cx43磷酸化保護心臟的作用機制仍不清。我們曾報導(dǎo)ACh可抑制缺氧引起Cx43表達降低并恢復(fù)Cx43功能［8］，本文繼續(xù)討論在缺氧條件下H9c2細胞Cx43磷酸化動態(tài)變化及ACh誘導(dǎo)Cx43分布改變。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)和藥物制劑

用含有10%胎牛血清（Sigma）、青霉素（100IU）、鏈霉素（100μg／ml）的 DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）（Sigma）培養(yǎng)液培養(yǎng)H9c2細胞，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱。ACh（Sigma，1mM）預(yù)處理 H9c2細胞1小時，隨后置于37℃、5%CO2，10%H2和85%N2的缺氧環(huán)境1小時。一氧化氮合成酶抑制劑N－硝基－L－精氨酸甲酯（N－nitro－L－arginine methyl ester，L－NAME）（Sigma，1mM）與ACh共同處理細胞1小時，隨后缺氧1小時。PKC抑制劑白屈菜赤堿（chelerythrine）（Sigma，5μM），ATP敏感鉀通道阻滯劑格列本脲（Glybenclamide）（Sigma，10μM），K－ATP 激動劑二氮嗪（Diazoxide）（Sigma，100μM）進行相同試驗。缺血預(yù)處理是缺氧環(huán)境5min，隨后正常氧環(huán)境5 min，反復(fù)3個循環(huán)周期。

1.2 免疫印跡

在相應(yīng)動態(tài)時間內(nèi)提取細胞蛋白備用免疫印跡［8］。細 胞 裂 解 液 ［50mM Tris－HCl（pH6.8），10% （wt／vol）十二烷基硫酸鈉，12% （vol／vol）二巰基乙醇，0.1% （vol／vol）溴酚藍（BPB），20%（wt／vol）甘油］裂解細胞，離心收集上清，進行10%聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate－polyacrylamid gel electrophoresis，SDS－PAGE））電泳，轉(zhuǎn)移蛋白到硝酸纖維膜上，第一抗體采用抗Cx43抗體（1∶1 000，Zymed），第二抗體采用抗兔IgG 抗體（1／1 000，BD），ECL Plus Western Blotting Detection Reagents（Amersham Biosciences）顯像分析。а－tubulin做對照，定量蛋白帶密度用Bldis軟件處理。

1.3 免疫組織化學(xué)

H9c2細胞用含4%多聚甲醛PBS室溫固定，0.1%Triton X－100的PBS處理細胞，5%脫脂牛乳孵育過夜，抗Cx43抗體（Zymed）孵育4℃過夜，Cy3標(biāo)記第二抗體（（Jackson ImmunoReserch）孵育4℃過夜。肌動蛋白用FITC標(biāo)記FITC－conjugated phalloidin做背景對照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)

2 結(jié)果

2.1 缺氧誘導(dǎo)Cx43磷酸化

Cx43有兩種形式，磷酸化Cx43（P－Cx43）和非磷酸化 Cx43（NP－Cx43）（圖 1）。我們曾報道［8］H9c2細胞暴露在缺氧環(huán)境中，隨著時間延長0、30、60min的P－Cx43和NP－Cx43呈現(xiàn)漸進性減少，60 min呈現(xiàn)顯著抑制 （P＜0.001vs 0min of hypoxia）。但是120min、240min呈現(xiàn)逐漸恢復(fù)，與60 min比較，雖然240min P－Cx43逐漸恢復(fù)（P＜0.001vs 60min of hypoxia），但是仍低于0min PCx43（P＜0.001vs 0min of hypoxia）。結(jié)果提示缺氧造成Cx43磷酸化的急速降低，隨后逐漸恢復(fù)。

圖1 Western blot檢測H9c2細胞在缺氧環(huán)境下不同時間點的Cx43表達

2.2 ACh誘導(dǎo)Cx43磷酸化

為驗證ACh是否調(diào)控Cx43磷酸化，我們用ACh處理H9c2細胞，Cx43磷酸化迅速升高持續(xù)至10min（P＜0.001vs 0min）（圖2），隨后逐漸降低（P＜0.001vs 10min）（圖2），峰值5min。

2.3 ACh抑制缺氧誘導(dǎo)Cx43降低

為了解在缺氧條件下ACh是否調(diào)控Cx43，用ACh預(yù)處理細胞1小時，隨后缺氧1小時，ACh抑制缺氧條件下Cx43磷酸化降低 （P＜0.001vs hypoxia）（圖3）。同樣結(jié)果觀察在具有減少心肌壞死和保護心臟作用的缺血預(yù)處理的Cx43（圖3）。

圖2 Western blot檢測H9c2細胞在正常氧環(huán)境下ACh誘導(dǎo)不同時間點的Cx43表達

圖3 Western blot檢測H9c2細胞在缺氧環(huán)境下不同調(diào)控方法的Cx43表達

進一步用免疫組化證實ACh調(diào)控Cx43。正常氧環(huán)境下可見Cx43表達，缺氧引起Cx43表達降低，然而ACh恢復(fù)缺氧誘導(dǎo)降低的Cx43表達。結(jié)合免疫印跡結(jié)果ACh抑制缺氧誘導(dǎo)Cx43磷酸化降低，恢復(fù)／激活Cx43功能。

2.4 ACh通過NO、ATP、KPC介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)Cx43磷酸化

為了解ACh誘導(dǎo)Cx43信號通路，我們研究化學(xué)藥物是否誘導(dǎo)Cx43表達（圖4）。在缺氧條件下，L－NAME抑制Cx43升高 （P＜0.001vs ACh＋hypoxia），同樣結(jié)果觀察在 Diazoxide（P＜0.05vs ACh ＋ hypoxia），而 Chelerythrine 和 Glybenclamide沒有呈現(xiàn)抑制作用。

3 討論

圖4 Western blot檢測H9c2細胞在缺氧環(huán)境下不同化學(xué)藥物調(diào)控Cx43表達

慢性缺血性心臟疾病與縫隙連接蛋白功能失調(diào)相關(guān)?？p隙連接生理功能依賴于組成縫隙連接通道的開放和關(guān)閉，而這種通道開放和關(guān)閉取決于連接蛋白，Cx43與其它細胞間分子ZO－1和鈣黏蛋白共同調(diào)控心肌細胞［9，10］。Cx43磷酸化便于縫隙連接通道形成、開放和Cx43非磷酸化轉(zhuǎn)換［11］，絲氨酸368、325、328和（或）330磷酸化在缺血早期可以影響通 道 選 擇 通 透 性 和 調(diào) 控 縫 隙 連 接 功 能［12，13］。Cx43磷酸化定位于閏盤，當(dāng)心臟缺氧時Cx43在閏盤發(fā)生去磷酸化，重新在質(zhì)膜分布［14］。本研究證明在缺氧條件下Cx43磷酸化和非磷酸化有顯著降低（圖5），提示缺氧激發(fā)縫隙連接蛋白改變。Beardslee等報道缺氧誘導(dǎo)的解偶聯(lián)與Cx43去磷酸化相關(guān)，在縫隙連接內(nèi)Cx43非磷酸化集聚，Cx43從縫隙連接遷移到細胞池［3］，而本研究未發(fā)現(xiàn)Cx43非磷酸化積聚（圖5）。

圖5 缺氧環(huán)境下不同時間點的Cx43表達水平比較分析

雖然大量文獻報道Cx43在SDS－PAGE 44－46 kDa和41kDa分別表現(xiàn)Cx43磷酸化和非磷酸化異構(gòu)體，但并沒有清晰證據(jù)證明哪個Cx43特異磷酸－氨基酸殘基和Cx43磷酸異構(gòu)體多樣性與心臟疾病相關(guān)，推測Cx43磷酸異構(gòu)體多樣性的可能原因是單克隆抗體能夠檢測遷移在SDS－PAGE分子量44－46kDa附近的幾種Cx43磷酸化異構(gòu)體［4］。

為進一步了解ACh誘導(dǎo)Cx43磷酸化機制，我們選擇不同化學(xué)藥物NO抑制劑、蛋白酶C抑制劑、ATP激活劑和阻滯劑誘導(dǎo)和分析Cx43表達探討ACh調(diào)控Cx43通路機制。NO主要生理功能是與可溶性鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)合增加cGMP產(chǎn)生，cGMP調(diào)控多種信號通路激活蛋白酶C或cAMP保護心臟。在缺血再灌注中PKC抑制劑增加預(yù)處理效果減少梗死面積、減輕收縮功能障礙和心律失常。Diazoxide通過抑制線粒體ATP合成酶［15］、激活鉀通道而保護心臟作用［16］。本研究證明NO和ATP鉀離子通路參與ACh上調(diào)Cx43表達的作用機制。

短暫的心肌缺血可增加心臟對隨后缺氧的耐受力，這種現(xiàn)象稱為缺血預(yù)處理（ischemic preconditioning，IP）。IP是一種心肌保護措施，可顯著降低心肌壞死和心肌缺血／再灌注損傷。本研究證明在缺氧條件下ACh調(diào)控Cx43蛋白具有與IP相同保護效果（圖3），可能的機制是Cx43羧基末端結(jié)構(gòu)參與分子內(nèi)和分子間相互作用調(diào)控縫隙連接［17］，ACh激活Cx43重新分布［18，19］，上調(diào)缺氧抑制的Cx43磷酸化表達，維持Cx43的磷酸化水平，高濃度Cx43磷酸化關(guān)閉縫隙連接通道作用，從而降低心肌細胞離子超載而發(fā)揮處于缺氧條件下心肌保護作用。ACh抑制缺氧引起Cx43磷酸化的降低仍有待進一步研究，可以肯定ACh誘導(dǎo)Cx43的心臟保護作用不是一個因子而是多個因子共同參與綜合作用的結(jié)果。Cx43異常表達影響心室肌細胞間電偶聯(lián)的穩(wěn)定，導(dǎo)致功能阻滯，誘發(fā)心律不齊［20］，因冠狀動脈粥樣硬化性狹窄而誘發(fā)急性心肌缺血是臨床心性猝死最常見原因之一，Cx43磷酸化改變是心肌缺血／缺氧引起心肌損傷的早期征兆，為進一步研究心臟疾病的診斷、治療和監(jiān)測提供可能；ACh作為激活因子激活內(nèi)源性心臟保護的信號通路，為今后藥物的研究和開發(fā)提供可能。

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