徐 寧，陳玉云，許國(guó)華，葉曉健

在臨床工作中越來(lái)越多的外傷、脊柱和關(guān)節(jié)疾病、骨腫瘤以及先天性的畸形的患者需要手術(shù)植骨治療，尋找一種與天然骨相似的骨替代材料已經(jīng)成為了生物材料研究的熱點(diǎn)之一。天然骨組織主要由2 大部分構(gòu)成，有機(jī)成分約占1/3 和無(wú)機(jī)成分約占2/3，其中有機(jī)成分的90%是膠原，無(wú)機(jī)成分則主要是羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)和少量的碳酸磷灰石、氟磷灰石等［1］。從結(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)，天然骨組織是一種具有復(fù)雜而精細(xì)分級(jí)結(jié)構(gòu)的有機(jī)和無(wú)機(jī)復(fù)合體，膠原分子與羥基磷灰石呈納米級(jí)的層狀排列［2］。骨組織的組成成分和結(jié)構(gòu)是相互獨(dú)立但又有關(guān)聯(lián)的2 個(gè)方面，共同決定了骨的性能。骨組織的成分基本固定，而不同的微觀結(jié)構(gòu)對(duì)骨的性能有很大影響，因此合成出在微結(jié)構(gòu)上與天然骨組織接近的生物材料對(duì)于骨材料性能的提升具有重要意義。Ⅰ型膠原蛋白(typeⅠcollagen)作為一種天然提取蛋白，其具有生物相容性，生物可降解性，力學(xué)性能，對(duì)細(xì)胞的粘附、擴(kuò)增、分化作用良好等優(yōu)勢(shì)，近幾年逐漸應(yīng)用于生物替代材料和組織工程材料。

納米羥基磷灰石/Ⅰ型膠原(HA/COL)復(fù)合物在組成成分上與天然骨基質(zhì)相似，對(duì)HA/COL 結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控從而可以使其具有高度的仿生性，有望從根本上克服傳統(tǒng)材料的缺陷［3］。本研究采用自組裝的方法合成出HA/COL 復(fù)合物，研究表明其結(jié)構(gòu)與天然骨的層片狀結(jié)構(gòu)極為相似。通過(guò)對(duì)HA/COL復(fù)合物性能進(jìn)行研究，為其在臨床的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

可溶性醫(yī)用Ⅰ型膠原，CaCl2，NaH2PO4，NaOH均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海)，并且均為分析純。α-MEM 培養(yǎng)基由Gibco 公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將1.8 g 膠原溶解于3 000mL 去離子水中，在室溫條件下充分溶解5 h，配制成0.6 mg/mL 的膠原溶液。取420 mL 濃度為0.1 mol/L 的CaCl2溶液加入配制好的膠原溶液中，在室溫下置于磁力攪拌器上混合 20 min。緩慢加入 NaH2PO4溶液(252 mL，0.1 mol/L)同時(shí)用0.1 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)pH 值，pH 值為7 時(shí)出現(xiàn)白色懸濁液，維持這時(shí)的飽和溶液的pH 值在7.0 持續(xù)24 h(室溫)。用離心機(jī)(5 000 r/min，5 min)離心飽和溶液，去除上清液，反復(fù)用去離子化水洗滌以去除鹽離子。把制備出的樣品在－80℃冰箱冷凍24 h 后取出，冷凍干燥24 h，制得HA/COL 復(fù)合材料白色粉末。

1.3 表征手段

X 射線粉末衍射儀(D/max-2600/pc，RIGAKU，日本)分析HA/COL 的晶體結(jié)構(gòu)，CuKα，4°/min 步長(zhǎng);透射電鏡TEM(JEM-2100F，Joel，日本)對(duì)HA 以及HA/COL 的微觀形態(tài)進(jìn)行觀察;傅里葉紅外光譜儀(Nicolet 6700，Thermo Fisher Scientific，美國(guó))對(duì)HA、HA/COL 進(jìn)行紅外光譜測(cè)試，吸收波數(shù)范圍4 000 cm-1～400 cm-1;熱重分析TG(STAPT 1 600，LINSEIS，德國(guó))測(cè)試HA/COL 燒結(jié)質(zhì)量，測(cè)試溫度范圍是室溫～800℃。

1.4 復(fù)合材料的細(xì)胞學(xué)毒性檢測(cè)

采用四唑鹽比色法(MTT 法)進(jìn)行復(fù)合材料的細(xì)胞學(xué)毒性評(píng)價(jià)。把小鼠MC3T3-E1 細(xì)胞鋪在96 孔板上，每孔大約1×105個(gè)細(xì)胞，加入新鮮α-MEM 培養(yǎng)基每孔100 μL，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)培養(yǎng)24 h;取HA/COL 復(fù)合材料200 mg 加入2 mL培養(yǎng)基中浸泡(200 mg/mL)24 h 后離心(3 000 r/min，10 min)取浸提液。將浸提液逐步梯度稀釋?zhuān)瑵舛确謩e為100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL。除去96 孔板上的培養(yǎng)基，依次加入上述濃度浸提液，每個(gè)濃度重復(fù)6 孔。放入恒溫培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)培養(yǎng)24 h 后每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMS0每孔100 μL，10～15 min后用酶標(biāo)儀在492 nm 波長(zhǎng)下測(cè)光密度(optical density，OD)值。

細(xì)胞相對(duì)增殖率(R)的計(jì)算公式:

R=OD492樣/OD492陰

式中:OD492樣為樣品的OD492;OD492陰為未加樣品空白對(duì)照的OD492

根據(jù)不同時(shí)期各組R 值采用5 分制法進(jìn)行細(xì)胞毒性分級(jí)評(píng)價(jià)［4］，見(jiàn)表1。當(dāng)R≥80%，說(shuō)明樣品對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)毒害作用，反之對(duì)細(xì)胞的增殖有毒害作用。

表1 美國(guó)藥典中細(xì)胞相對(duì)增殖率(R)與細(xì)胞毒性分級(jí)關(guān)系Tab.1 Relationship of cell proliferation rate(R)and cell toxicity grade in American pharmacopeia

1.5 小鼠MC3T3-E1 細(xì)胞在復(fù)合材料表面的生長(zhǎng)情況觀察

將HA/COL 復(fù)合物至于無(wú)水乙醇中，在超聲振蕩機(jī)中使其均勻分散，采用靜電噴涂法將HA/COL復(fù)合物均勻噴涂于鈦片表面(直徑10 mm，厚度5 mm)作為實(shí)驗(yàn)組。同樣方法處理羥基磷灰石粉末作為對(duì)照組。將鈦片滅菌后置于16 孔板中，每孔加入濃度為1×105/mL 的MC3T3-E1 細(xì)胞懸液1mL，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，于1 d、3 d、7 d后掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料表面生長(zhǎng)情況。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)合材料的晶粒尺寸和微觀結(jié)構(gòu)

圖1 為HA 與HA/COL 復(fù)合物的透視電鏡圖片。圖a，b 示HA 晶粒形狀為棒狀，晶粒尺寸長(zhǎng)度＜100 nm，寬度為(35±4)nm。圖c，d 示HA/COL 晶粒形狀為針狀，長(zhǎng)度為(130±10)nm，寬度為(10±2)nm。該結(jié)果說(shuō)明COL 的加入明顯調(diào)控了HA 晶粒的形貌和尺寸，晶粒由棒狀變?yōu)獒槧?，長(zhǎng)度增長(zhǎng)，寬度變窄，長(zhǎng)徑比明顯增大。圖a 中HA 晶粒呈無(wú)序、隨機(jī)、雜亂分布;圖d 中HA 晶粒密集交錯(cuò)并呈現(xiàn)層片狀的有序分布;上述現(xiàn)象說(shuō)明HA 以COL 為基質(zhì)，在COL 中有序排布［5］，COL 明顯影響HA 晶粒在基質(zhì)中的排布次序。

2.2 復(fù)合材料的物相和結(jié)晶度分析

圖1 HA 和HA/COL 透視電鏡圖片F(xiàn)ig.1 Transmission electron microscope images of HA and HA/COL

圖2 是HA，HA/COL 及天然骨的X 線粉末衍射圖譜。由圖可見(jiàn)，3 種樣品的衍射圖譜在衍射峰位置上基本一致，加入COL 后并未出現(xiàn)其他晶相的衍射峰，所有衍射峰都?xì)w屬于HA晶相;HA/COL樣品中(002)晶面的衍射峰強(qiáng)度明顯高于另外2 個(gè)樣品，(202)晶面的衍射峰峰型增寬，接近于天然骨(202)晶面的衍射峰峰型;上述現(xiàn)象說(shuō)明COL 具有誘導(dǎo)HA 在(002)晶面擇優(yōu)取向的作用，HA/COL 的結(jié)構(gòu)更加接近于天然骨。

圖2 HA，HA/COL 及天然骨的X 線粉末衍射圖譜Fig.2 X-ray diffraction patterns of HA，HA/COL with natural bone

2.3 復(fù)合材料的紅外光譜分析

圖3 是HA，HA/COL，COL 及天然骨的對(duì)比傅里葉變換紅外光譜學(xué)圖譜。HA 曲線中3 420 cm-1和1 033 cm-1、957 cm-1、分別對(duì)應(yīng)的是HA 的特征基團(tuán)OH-和PO43-的吸收峰;COL 曲線中1 624 cm-1，1 514 cm-1，1 234 cm-1分別為蛋白酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的吸收峰。這些特征峰也都出現(xiàn)在了HA/COL 樣品中，并且沒(méi)有其他新的特征峰，說(shuō)明COL 與HA 發(fā)生吸附。相對(duì)比于COL 樣品，HA/COL 樣品中的酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基團(tuán)向高波數(shù)位移，基本上酰胺Ⅰ的吸收峰從1 624 cm-1移動(dòng)到1 632 cm-1左右，酰胺Ⅱ的吸收峰從1 514 cm-1移動(dòng)到1 528 cm-1左右，酰胺Ⅲ的吸收峰從1 234 cm-1移動(dòng)到1 240 cm-1左右，特征吸收峰發(fā)生挪移說(shuō)明了HA/COL 中HA 與COL 分子鏈之間產(chǎn)生了化學(xué)鍵合。

圖3 HA，HA/COL，COL 及天然骨的傅里葉變換紅外光譜學(xué)圖譜Fig.3 Fourier transform infrared spectroscopy of of HA，HA/COL，COL and natural bone

2.4 復(fù)合材料的細(xì)胞學(xué)毒性評(píng)價(jià)

利用MTT 法評(píng)價(jià)不同濃度的HA 及HA/COl 浸提液對(duì)小鼠MC3T3-E1 細(xì)胞活性的影響(見(jiàn)圖4)。培養(yǎng)24 h 后，HA 和HA/COL 2組樣品的細(xì)胞相對(duì)增殖率(R)都＞80%，這說(shuō)明樣品對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)毒害作用。同時(shí)，浸提液濃度對(duì)細(xì)胞活性的有直接影響:隨著浸提液濃度降低，其細(xì)胞相對(duì)增殖率升高;反之逐步降低。當(dāng)浸提液濃度＜50 mg/mL 時(shí)，HA/COL 的細(xì)胞相對(duì)增殖率均＞100%，表現(xiàn)為0 級(jí)毒性。

圖4 不同濃度的樣品經(jīng)過(guò)24 h 共培養(yǎng)后對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Cell viability after cultured with diffident concentrations of samples for 24 h

2.5 細(xì)胞在復(fù)合材料表面的生長(zhǎng)情況

圖5 為小鼠MC3T3-E1 細(xì)胞在復(fù)合材料表面生長(zhǎng)情況。如圖所示，實(shí)驗(yàn)組材料表面的粗糙度明顯大于對(duì)照組，7 d 后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量均有所增加。培養(yǎng)1 d 后可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量明顯大于對(duì)照組，說(shuō)明HA/COL 復(fù)合物對(duì)于細(xì)胞的粘附起到顯著作用。在細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)組合對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)基本一致，說(shuō)明HA/COL 復(fù)合物不會(huì)改變細(xì)胞形態(tài)。

3 討 論

理想的骨替代材料不僅要求在組成成分上與自然骨相似，而且在微觀結(jié)構(gòu)上也應(yīng)該接近于自然骨，并具有良好的理化性能及生物相容性［6-7］。HA/COL 復(fù)合物相對(duì)于有機(jī)和金屬體內(nèi)置入材料來(lái)說(shuō)，具有良好的生物活性和生物相容性［8-9］，置入體內(nèi)安全無(wú)毒，并且具有良好的可降解性、骨誘導(dǎo)性和傳導(dǎo)性［10］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)控制一定的工藝過(guò)程，采用自組裝法，制備出微觀結(jié)構(gòu)與自然骨相似的層片狀HA/COL 復(fù)合物，達(dá)到了在組成成分與組成結(jié)構(gòu)上雙重仿生的目的。

圖5 細(xì)胞在復(fù)合材料表面生長(zhǎng)情況掃描電鏡圖片(×300)Fig.5 Scanning electron microscopy images of cell growing on HA/COL surface(×300)

通過(guò)對(duì)HA/COL 復(fù)合物的理化特性進(jìn)行分析可以看出，COL 的加入使HA 晶粒的形狀由原來(lái)的棒狀變?yōu)獒槧?，長(zhǎng)度增長(zhǎng)，寬度變窄，長(zhǎng)徑比明顯增大，而晶粒尺寸仍在納米尺度范圍內(nèi);HA 晶粒呈現(xiàn)出密集交錯(cuò)的層片狀分布。上述現(xiàn)象是由于在礦化組織中規(guī)整的結(jié)構(gòu)都是源于生物大分子的規(guī)整的自組裝，COL 作為模板控制HA 的結(jié)晶、生長(zhǎng)、尺寸和形貌。HA/COL 復(fù)合物的X 線粉末衍射圖譜分析可見(jiàn)膠原的加入并未改變HA 的晶相，同時(shí)使得(002)晶面的衍射峰更加接近于自然骨的衍射峰，說(shuō)明COL 具有誘導(dǎo)HA 在(002)晶面擇優(yōu)取向的作用，并使HA/COL 復(fù)合物在物相上更加接近于自然骨。最后對(duì)HA/COL 復(fù)合物進(jìn)行了傅里葉變換紅外光譜學(xué)圖譜分析，可以看出在HA/COL 復(fù)合物樣品中出現(xiàn)了HA 的特征基團(tuán)OH-和PO43-的吸收峰以及蛋白酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的吸收峰，并且蛋白酰胺的3 個(gè)吸收峰都發(fā)生了向高波位的紅移現(xiàn)象，說(shuō)明COL 與HA 發(fā)生了吸附并產(chǎn)生了分子鏈之間的化學(xué)鍵合而不是單純的物理混合。

采用MTT 法對(duì)HA/COL 復(fù)合物的細(xì)胞毒性進(jìn)行測(cè)試，可以看出當(dāng)復(fù)合物浸提液濃度＜50 mg/mL時(shí)，細(xì)胞增值率均＞100%，細(xì)胞毒性表現(xiàn)為0 級(jí)毒性。但當(dāng)浸提液濃度為100 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞增值率＞80%，表現(xiàn)為1 級(jí)毒性，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖率均小于對(duì)照組。以上現(xiàn)象可能是由于自組裝法在制備復(fù)合物過(guò)程中的分離提純不夠完全，以及所購(gòu)買(mǎi)的膠原蛋白摻有雜質(zhì)。但盡管如此，復(fù)合物的細(xì)胞毒性表現(xiàn)為0-1 級(jí)，符合ISO10993(GB/T16886)標(biāo)準(zhǔn)。從小鼠MC3T3-E1 細(xì)胞在材料表面的生長(zhǎng)情況可以看出，復(fù)合物對(duì)細(xì)胞有明顯的增強(qiáng)粘附作用，并且不改變細(xì)胞形態(tài)，說(shuō)明復(fù)合物對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用，與細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相吻合。

綜上所述，采用自組裝法合成的HA/COL 復(fù)合物微觀結(jié)構(gòu)與自然骨相似，COL 與HA 之間產(chǎn)生了化學(xué)鍵合，晶粒尺度在納米范圍內(nèi)，無(wú)細(xì)胞毒性，細(xì)胞在其表面生長(zhǎng)狀態(tài)良好。是一種良好的人工骨支架材料。

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