王 浩，劉燕波，李文穎，孟 爾，2，柳 瓏

(1.國防科學(xué)技術(shù)大學(xué)理學(xué)院，湖南長沙 410073;2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南長沙 410006)

蜘蛛多肽類毒素異源表達的研究進展＊

王 浩1*，劉燕波2*，李文穎1，孟 爾1，2，柳 瓏1

(1.國防科學(xué)技術(shù)大學(xué)理學(xué)院，湖南長沙 410073;2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南長沙 410006)

蜘蛛毒液是一個巨大的天然多肽和蛋白質(zhì)分子組合庫，具有多種生物學(xué)功能.但僅靠從天然的蜘蛛中提取出研究所需的蜘蛛多肽類毒素遠不能滿足對其的全面研究和開發(fā)利用.相比化學(xué)的固相合成法合成的低產(chǎn)量和較高成本，利用基因工程的方法異源表達蜘蛛毒素有較大的優(yōu)勢.綜述了近年來利用大腸桿菌表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、昆蟲表達系統(tǒng)和植物表達系統(tǒng)異源表達蜘蛛毒素的研究進展.

蜘蛛多肽類毒素;胞內(nèi)表達;分泌表達

蜘蛛在分類學(xué)上屬于節(jié)肢動物門，蛛形綱，蜘蛛目.蜘蛛是世界上最古老的物種之一，其種類數(shù)目僅次于昆蟲，分布也極為廣泛.據(jù)統(tǒng)計全世界共發(fā)現(xiàn)蜘蛛40000多種［1］.除了hackled orbweavers(Uloboridae)和primitive mesothelids中的某些種類外，其它所有蜘蛛都具有毒腺［2］.蜘蛛毒液成分較多，依據(jù)其理化性質(zhì)可分為多肽類與多胺類.多肽類神經(jīng)毒素根據(jù)分子量的大小又可以分為高分子量毒素和低分子量毒素兩類［3］:高分子量毒素存在于黑寡婦蜘蛛毒液中，如α－latrotoxin，相對分子質(zhì)量在100 Da以上，能作用于突觸前膜，并促使神經(jīng)遞質(zhì)的大量釋放;低分子量毒素相對分子質(zhì)量相對較小，一般在100×103～12×103Da之間，可與Na+、K+、Ca2+等各種離子通道相互作用.蜘蛛毒液是一個巨大的天然組合庫，它們具有多種生物學(xué)功能;開發(fā)蜘蛛毒液這個寶藏，很可能發(fā)現(xiàn)一些藥物先導(dǎo)分子、藥理學(xué)研究的工具試劑和生物殺蟲劑等.

目前研究用的蜘蛛毒素大部分從天然的粗毒中提取出來或用固相合成法獲得，但隨著環(huán)境的改變，蜘蛛的種類和數(shù)量急劇減少，僅靠天然資源遠不能滿足對毒素的全面研究和開發(fā)利用的需要.利用固相合成法合成蜘蛛毒素，每次合成量有限，并且試劑昂貴，成本很高.所以采用基因工程的方法來表達這些蜘蛛毒素多肽基因就變得尤為重要.目前，比較成熟的表達系統(tǒng)包括大腸桿菌表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)和植物表達系統(tǒng).

1 大腸桿菌表達系統(tǒng)

大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前掌握最為成熟的原核表達系統(tǒng)，具有遺傳背景清楚、成本低、表達量高和表達產(chǎn)物分離純化相對簡單等優(yōu)點.大腸桿菌的表達載體可分為非融合型表達載體和融合型表達載體兩種.大腸桿菌表達系統(tǒng)的宿主細菌大部分是大腸桿菌BL21(DE3)以及其衍生菌種.

近年來，一些編碼低分子量的蜘蛛毒素基因在大腸桿菌胞內(nèi)表達系統(tǒng)中得到成功表達的例子多有報導(dǎo).1993年Diniz，M.R.等人利用表達載體pET32c(+)在大腸桿菌AD494(DE3)pLysS中成功表達出Phoneutria nigriventer的鈉離子通道抑制劑 Txl［4］.2003 年 Carneiro，A.M.等人用質(zhì)粒 pMAL －c2在胞內(nèi)成功表達出PnTx3－1，其N端有一個42.7 kDa的麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)作為融合蛋白［5］.2011年孟爾等人用表達質(zhì)粒 pET－40b成功表達出虎紋捕鳥毒素 －Ⅰ［6］(HWTX－Ⅰ).此外，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)也表達了一些編碼較大分子量的蜘蛛蛋白基因.蜘蛛Loxosceles intermedia中的皮膚壞死毒素:磷脂酶 D(33 kDa)、LiRecDT2(33.8 kDa)、LiRecDT3(34 kDa)、LiRecDT4(34 kDa)和 LiRecDT5(37 kDa)利用表達載體 pET －14b成功表達［7－9］;大腸桿菌胞內(nèi)表達系統(tǒng)也有它的缺陷，主要表現(xiàn)在目的蛋白質(zhì)翻譯后缺乏加工機制，如二硫鍵的形成與蛋白糖基化，因此通過大腸桿菌表達系統(tǒng)異源表達的含二硫鍵的多肽蜘蛛毒素不具有生物活性的幾率較大.2000年李敏等用pGEX－KT成功地將HWTX－I與GST融合表達，但由于在表達過程中沒有形成三對二硫鍵，導(dǎo)致最后得到的表達產(chǎn)量較低且生物學(xué)活性明顯低于天然毒素［10］.不過可以采取大腸桿菌的周質(zhì)表達來解決二硫鍵配對的問題，已經(jīng)有研究表明在大腸桿菌周質(zhì)中，能成功獲取具有和天然功能一致的 HWTX－I與HWTX － IV［6，11］.

2 酵母表達系統(tǒng)

酵母表達系統(tǒng)是一種兼具原核以及真核表達系統(tǒng)的優(yōu)點的外源蛋白表達系統(tǒng)，具有表達量高，可誘導(dǎo)，糖基化機制接近高等真核生物，分泌蛋白易純化，高密發(fā)酵等優(yōu)點.用酵母表達系統(tǒng)表達蜘蛛毒素基因的例子還不是很多.將來源于Gramostola spatulata的編碼毒素GsMTx4的基因利用質(zhì)粒pPICZα在畢赤酵母中成功分泌表達，表達量為100 mg/L，毒素的功能是緩解機械和神經(jīng)性疼痛［12］.Fitches，E.等人用表達質(zhì)粒pGAPZaA在野生型的X33畢赤酵母株中也分泌表達出殺蟲肽SFIl，在X33和SMDll68H株中融合表達SFI1/GNA(GNA是雪蓮花凝集素)［13］，實驗證明表達產(chǎn)物對Nllaparvata lugens的幼蟲有毒害作用［14］.2002年聶東宋等用表達質(zhì)粒pPIC9K在畢赤酵母中成功表達自虎紋捕鳥蛛的編碼HWTX－I的基因，表達量達到80 mg/L，但表達產(chǎn)物N端多余4個氨基酸殘基，且C端不均一［15］;彭寬等用表達質(zhì)粒pVT102U/α在釀酒酵母S78株中成功表達自虎紋蜘蛛的毒素HWTX－XI基因，表達產(chǎn)物和天然毒素一致，且形成了正確的二硫鍵［16］.

表1 部分已表達的蜘蛛毒素

3 昆蟲表達系統(tǒng)

昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)是目前國內(nèi)外十分推崇的真核表達系統(tǒng).利用桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強啟動子構(gòu)建的表達載體，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達.它具有真核表達系統(tǒng)的翻譯后加工功能，如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等，使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白;其最高表達量可達昆蟲細胞蛋白總量的50%;可表達非常大的外源性基因(約200 kDa);昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)常用的桿狀病毒包括苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)和家蠶型多角體病毒(BmNPV)，常用的宿主細胞則來源于草地夜蛾Sf9細胞，用于表達外源基因的質(zhì)粒來源于PUC系列，其含有一個多克隆位點和多角體蛋白啟動子.目前采用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達蜘蛛毒素的報道不多.Grishin等將來源于黑寡婦蜘蛛(Latrodectus tredecYmguttatus)的毒素α－LTX的cDNA克隆入轉(zhuǎn)移載體pMelBacA，轉(zhuǎn)入Sf9細胞，同源重組形成重組的桿狀病毒AcMNPv－α－LTX－M，經(jīng)PCR鑒定后，轉(zhuǎn)入Hi5細胞進行大量表達，表達量為每升細胞培養(yǎng)液0.2 －0.3 mg目的蛋白［17］.通過 SDS電泳及質(zhì)譜鑒定毒素α－LTX的分子量為131 kDa，這樣的大分子量蛋白質(zhì)，如果采用大腸桿菌表達系統(tǒng)可能會由于目的蛋白質(zhì)不能正確的折疊導(dǎo)致表達失敗.但通過昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達得到的產(chǎn)物則具有和天然毒素一樣的功能;Ji等把編碼HWTX－I的成熟肽基因序列克隆到質(zhì)粒pFastbacl中，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞DH10Bac中，接著用重組的桿狀病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Sf9細胞進行表達，表達產(chǎn)物也具有和天然毒素相似的生物功能［18］.

4 植物表達系統(tǒng)

植物能夠表達來自動物、細菌、病毒以及植物本身的蛋白質(zhì)，易于大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)，且在基因表達與修飾及安全性方面有特別的優(yōu)勢.由于利用植物表達外源性蛋白起步較晚目前，來源于蜘蛛的抗蟲基因構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因植物報道還相對較少.2006年Khan，S.A等人利用表達質(zhì)粒pGreen0029在煙草中成功表達出蜘蛛Htadronyehe versuta的昆蟲特異的鈣離子通道抑制劑 ω －ACTX －Hvla［19］.

5 小結(jié)與展望

從目前的研究來看，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達蜘蛛毒素應(yīng)用得最為廣泛，且多用于表達分子量較小的毒素.而酵母表達系統(tǒng)、昆蟲表達系統(tǒng)等真核表達系統(tǒng)則在表達分子量相對較大的毒素方面更容易獲得成功.雖然目前只有一小部分的蜘蛛毒素多肽基因可以通過基因工程的手段實現(xiàn)異源表達，甚至有的毒素基因表達出來的產(chǎn)物并不完全具備天然毒素的生理活性.但是我們?nèi)匀荒軓倪@些成功例子中看出采用基因工程的方法來表達蜘蛛毒素多肽基因是我們獲取蜘蛛毒素的一個行之有效的方法，也是未來具有較大發(fā)展的一個方法.

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Q51

A

1008－4681(2012)02－0032－03

2012－01－05

國家自然科學(xué)基金(批準號:30971432)資助項目;國家973項目(批準號:2010CB529800).

王浩(1987－)，男，江蘇泰州人，國防科學(xué)技術(shù)大學(xué)理學(xué)院碩士生.研究方向:生物醫(yī)學(xué)工程;劉燕波(1987－)，男，湖南新華人，湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士生.研究方向:生物化學(xué)、分子生物學(xué).* 并列第一作者.

(作者本人校對)