王國富，白 麗，薛士鵬，吳利先

（大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

福氏志賀菌ipaB基因的克隆及序列測定

王國富，白 麗，薛士鵬，吳利先*

（大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：克隆福氏志賀菌（Shigella flexneri，S.flexne）的ipaB基因。方法：以福氏志賀菌2a 2457T（Nal）r為模板，用PCR擴增ipaB目的基因片段，克隆至pQE-30表達(dá)載體中，構(gòu)建含目的基因的表達(dá)質(zhì)粒pQE-ipaB。結(jié)果：構(gòu)建了重組質(zhì)粒pQE-ipaB，ipaB基因全長1 743 bp，經(jīng)測序分析與預(yù)期相符。結(jié)論：成功克隆了ipaB基因。

福氏志賀菌；ipaB基因；克隆；測定；一致

志賀氏菌引起的細(xì)菌性痢疾為一種全球性的腸道傳染病。據(jù)估計，全世界每年感染的人數(shù)超過兩億，由該病引起的死亡人數(shù)有65萬左右〔1〕。福氏志賀菌（Shigella flexneri，S.flexneri）是細(xì)菌性痢疾的重要致病菌之一〔2〕。細(xì)菌性痢疾的發(fā)生開始于細(xì)菌侵入腸上皮細(xì)胞，引起局部細(xì)胞的壞死和炎癥反應(yīng)。目前研究認(rèn)為，細(xì)菌性痢疾的發(fā)病機制主要與志賀菌的毒力質(zhì)粒有關(guān)，消除該質(zhì)粒后志賀菌的致病力也隨之消失：毒力質(zhì)粒上一個31 kb大小的片斷是細(xì)菌侵襲所必需的，編碼多種與侵襲相關(guān)的基因：其中由它編碼合成的侵襲質(zhì)?？乖↖pa）A，B，C，D是志賀菌侵入腸上皮細(xì)胞所必需的〔3-4〕。目前認(rèn)為，在菌體外，IpaB和IpaC蛋白以復(fù)合物形式存在，從而介導(dǎo)志賀菌侵入腸上皮細(xì)胞〔5-6〕。所以，本實驗選擇其中一個與志賀菌毒力明顯相關(guān)的基因ipaB為靶基因，從福氏志賀菌2a 2457T（Nal）r菌株進(jìn)行克隆，克隆了ipaB，為進(jìn)一行研究IpaB的表達(dá)和志賀菌發(fā)病機制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 福氏志賀菌2a 2457T（Nal）r由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所王恒梁博士惠贈。原核表達(dá)載體pQE-30質(zhì)粒為大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室保存。限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶（快速連接試劑盒）、KpnI、SalI、PCR純化試劑盒為Takara Bio公司產(chǎn)品，DNA膠回收試劑盒購自Tian gen公司。高保真Tag DNA聚合酶、dNTP購自北京晨綠公司。

1.2 菌株培養(yǎng) 將福氏志賀菌2a 2457T（Nal）r接種在含0.025%剛果紅和40 μg/mL萘啶酮酸（Nal）的水解大豆瓊脂（Tryptiscase soy agar，TSA）平皿上劃線培養(yǎng)，挑取紅色菌落接種于水解大豆肉湯（Tryptiscase soy broth，TSB）培養(yǎng)基在37℃140轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)備用。

1.3 基因的擴增 取TBS培養(yǎng)過夜的福氏志賀菌2a 2457T（Nal）r50 uL，12000轉(zhuǎn)5 min離心棄上清液后加50 uL去離子水，煮沸10 min，12 000轉(zhuǎn)離心5 min，取上清液2 uL作為PCR模板，反應(yīng)體系中加入dNTP 4 μL，10×PCR buffer緩沖液5 μL，Mg2+4 μL，TagDNA聚合酶1 uL，引物P1、P2各1 μL，補水至50 μL。反應(yīng)條件為:95℃4 min后，按下列參數(shù)擴增30個循環(huán)，即94℃變性60 s，52℃退火60 s，72℃延伸60 s，30個循環(huán)后72℃再延伸8 min。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 PCR擴增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠70 V、50 mA電泳，在熒光燈下將擴增片段條帶切下，用北京Tian gen DNA膠回收試劑盒回收目的片段，質(zhì)粒pQE-30和目的基因經(jīng)KpnI和SalI雙酶切，用PCR純化試劑盒回收酶切片段，用T4DNA連接酶試劑盒在16℃連接4 h，轉(zhuǎn)化到TOP-10宿主菌，雙酶切鑒定篩選出陽性克隆。挑取陽性克隆接種于LA（含Amp 100 mg/L）液體培養(yǎng)基中，增菌備用。

1.5 序列測定 取鑒定后篩選出的陽性克隆重組質(zhì)粒送往北京晨綠公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

2.1 ipaB基因的PCR擴增產(chǎn)物 根據(jù)基因文庫中的ipaB基因序列設(shè)計引物如下P1:5′-CC GGTACC ATG AAA GCA AAT AAT C-3′P2:5′-CC GTCGAC TTA TCG GTT TCT-3′由上海生工公司合成。P1引入內(nèi)切酶KpnI的酶切位點，P2引入內(nèi)切酶SalI的酶切位點。ipaB基因全長1 711 bp，其PCR結(jié)果見圖1。

圖1 ipaB PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重組質(zhì)粒pQE-ipaB經(jīng) KpnI、SalI雙酶切鑒定結(jié)果見圖2，能切出與ipaB大小相符的片段（1711bp），表明基因克隆成功。

圖2 重組質(zhì)粒pQE30-ipaB的鑒定

2.3 重組質(zhì)粒pQE-ipaB的序列分析 利用pQE-30的通用引物，由北京晨綠公司進(jìn)行測序后進(jìn)行序列分析。測序結(jié)果與文獻(xiàn)〔3〕報道一致，見圖3。

圖3 ipaB基因的序列圖譜

3 討論

存在于志賀菌中214 Kb大小的毒力質(zhì)粒上的一個大小為31 kb大小的編碼Ipa/mxi-spa蛋白的致密基因被認(rèn)為是志賀菌的毒力島（PAI）。PAI編碼著與侵襲相關(guān)的多數(shù)基因，其中侵襲性相關(guān)基因（Ipa）B，C，D是重要組成成分之一〔7-8〕。志賀菌致病的第一步是侵入腸上皮細(xì)胞，毒力質(zhì)粒上位于同一轉(zhuǎn)錄單位的ipaBCD的表達(dá)產(chǎn)物IpaBCD為志賀菌侵入上皮細(xì)胞所必需的。其中，IpaC與IpaB形成可溶性復(fù)合物IpaB-IpaC。IpaB-IpaC復(fù)合物可能與位于上皮細(xì)胞基底面整合素α5β1結(jié)合，誘發(fā)靶細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶活性改變，發(fā)生信號級聯(lián)放大作用，從而介導(dǎo)志賀菌的入侵〔9-10〕。所以，IpaB在志賀菌入侵腸上皮細(xì)胞中的作用很重要，有必要對其進(jìn)行深入研究。

本實驗選擇福氏志賀菌毒力質(zhì)粒上編碼的侵襲蛋白基因ipaB作為研究對象，并成功地將該基因擴增、克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-30中，構(gòu)建了pQE-ipaB重組質(zhì)粒，這將為進(jìn)一步研究IpaB的表達(dá)及免疫學(xué)功能，以及研究細(xì)菌性痢疾的發(fā)病機制提供依據(jù)。

〔1〕Kotloff K L，Winickoff J P，Ivanoff B，et al.Global burden of Shigella infections:implications for vaccine development and implementation of control strategies〔J〕. Bull World Health Organ，1999，77:651-661.

〔2〕王國富，白麗.志賀菌的致病機制研究進(jìn)展〔J〕.國際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志.2011，38（2）：137-139.

〔3〕Menard R，Dehio C，Sansonetti PJ.Bacterial entery into epithelial cells:the paradigm of Shigellosis〔J〕.Trends Microbiol，1996，4（6）:220-226.

〔4〕薛世鵬，王國富，吳利先.志賀菌的疫苗研究進(jìn)展〔J〕.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2011，11（9）：1167-1169.

〔5〕Sasakawa C，Kamata K，sakai T，et a1.Virulence-assosiated genetic regions comprising 31 kilobases of the 230.kilobaseplamaid in Shigella flexneri 2a〔J〕.J Bacteriol， 1998（170）：2480-2484.

〔6〕Menard R，Dehio C，Sansonetti P J.Bacterial entery into epithelial cells：the paradigm of Shigellosis〔J〕.Trends Microbiol，1996（4）:220-226.

〔7〕Hamiaux C，Van EA，Parsot C，et al.Structural mimicry for vinculin activation by IpaA，a virulence factor of Shigella flexneri〔J〕.EMBO Rep，2006，7（8）:794-799.

〔8〕Schroeder GN，Hilbi H.Molecular pathogenesis of Shigella spp.:controlling host cell signaling，invasion，and death by type III secretion〔J〕.Clin Microbiol Rev，2008，21（1）:134-156.

〔9〕Sani M，Botteaux A，Parsot C，et al.IpaD is localized at the tip of the Shigella flexneri type III secretion apparatus〔J〕.Biochim Biophys Acta，2007，1770（2）:307-311.

〔10〕Ramarao N，Le CC，Izard T，et al.Capping of actin filaments by vinculin activated by the Shigella IpaA carboxyl-terminal domain〔J〕.FEBS Lett，2007，581（5）: 853-857.

Cloning and Sequencing of IpaB Gene of Shigella flexneri

WANG Guofu,BAI Li,XUE Shipeng,WU Lixian*
（Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective：To clone and sequence of ipaB gene of Shigella flexneri.Methods：IpaB gene was amplified by PCR.The DNA products of ipaB were inserted into a prokaryotic expression vector pQE-30,and then translated into E.coli strain Top10,restriction digestion and sequencing.Results：The recombinant plasmid was constructed and ipaB gene was sequenced as 1 743 bp,conformity with expectation.Conclusion：The results indicated that recombinant plasmid was constructed successfully.

Shigella flexneri；ipaB gene；cloning；assay;conformity

R373［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號］1672-2345（2012）03-0028-03

云南省教育廳科研基金重點資助項目（2009z0078）

2011-12-05

王國富，副教授，主要從事醫(yī)學(xué)微生物與免疫學(xué)研究.

*通信作者：吳利先，教授.

（責(zé)任編輯 董 杰）