張鈺哲

（大理學院基礎醫(yī)學院，云南大理 671000）

離體大鼠腸內菌群對知母甾體皂苷代謝研究

張鈺哲

（大理學院基礎醫(yī)學院，云南大理 671000）

目的：觀察大鼠腸內菌對知母主要活性成分甾體皂苷的代謝及對相應代謝產物進行鑒定。方法：離體培養(yǎng)大鼠腸道菌群，用LC/MS/MS法檢測離體腸內菌對甾體皂苷樣品的代謝產物。灌胃給予大鼠甾體皂苷樣品15 mg·kg-1，于給藥后不同時間采集尿樣及糞樣，用LC/MS/MS法檢測甾體皂苷樣品的代謝產物。對主要代謝物M1進行結構鑒定。用合成的方法制備代謝物M1標準品進行LC/MS/MS法分析并與大鼠離體和在體樣品對比。結果：甾體皂苷樣品容易被大鼠消化道菌群代謝，代謝速率很快，其主要代謝產物為代謝物M1，隨著代謝時間的延長，代謝物M1的量逐漸增多，而甾體皂苷樣品的量則下降迅速。結論：甾體皂苷可被大鼠腸內菌迅速代謝。

甾體皂苷；腸內菌群；代謝物；液-質聯用法

甾體皂苷（steroidal saponin）是由螺甾烷類化合物衍生的寡糖苷，是一類重要的中藥活性成分，許多常用中藥如重樓、黃精、薤白、知母、蒺藜、穿山龍、麥冬等都含有甾體皂苷。研究表明，甾體皂苷具有改善心血管活性，抗癌、抗癡呆、抗病原微生物、降血糖及雌激素樣作用。許多主要含甾體皂苷的中成藥早已上市，如地奧心血康膠囊、心腦舒通、冠心寧、宮血寧及金剛藤膠囊等。甾體皂苷已成為藥物研究開發(fā)的重要先導化合物。目前發(fā)現中藥中含有兩個糖鏈的水溶性甾體皂苷具有顯著上調膽堿能n受體數量、改善腦循環(huán)、防治老年性癡呆等作用。經構效關系研究，發(fā)現呋甾皂苷單體化合物有一定的抗癡呆效果。口服甾體皂苷可顯著改善多種擬癡呆模型動物的學習記憶功能，并觀察到甾體皂苷對模型動物的腦源性神經生長因子（Brain-derived growth factor，BDNF）、細胞間黏附分子（Intercellular adhesion molecule，ICAM）、血管細胞黏附分子（Vascular cell adhesion molecule，VCAM）、腦組織超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性及丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量的顯著調節(jié)作用。甾體皂苷改善學習記憶功能的機理，一方面是通過上調膽堿能n及m受體，另一方面是通過擴張血管、抑制血栓形成、改善腦缺血及其損傷實現。經過充分的藥效學研究擬將其開發(fā)為抗老年性癡呆中藥的一類新藥。然而藥代動力學研究表明，原形藥物的生物利用度非常低，小于1%，提示應對其代謝產物進行研究?？诜幬锏拇x主要通過肝臟和腸道菌群，而中藥等天然化合物的代謝與腸道微生菌群關系密切。天然皂苷腸道代謝的研究以日本學者小橋恭一教授為先導者，他先后證明人參皂苷、甘草皂苷等多種中藥皂苷口服大多經腸道內細菌轉化或代謝后所產生的活性代謝產物入血發(fā)揮其療效。并提出了天然前藥的概念〔1〕。本文研究了活體和離體狀態(tài)下大鼠腸內菌群對甾體皂苷樣品的代謝并鑒定其代謝產物，提供主要代謝產物的時－量變化關系。方法采用液-質聯用法（LC-MS/MS）。目前文獻中對皂苷等天然化合物的代謝研究方法通常為薄層板分離后再用質譜進行檢測。此種方法靈敏度較低，測定時基質干擾嚴重，本研究經過方法摸索，建立了更靈敏的液-質聯用法，能夠同時提供色譜峰面積和分子量、子離子碎片信息。研究腸內菌群對甾體皂苷樣品的代謝及鑒定其代謝產物的結構，對進一步研究代謝產物的活性，闡明其藥理作用的真正分子基礎有重要意義。

本研究所使用的甾體皂苷樣品的分子式為C45H76O19，分子量為920，其結構如圖1。

圖1 樣品甾體皂苷結構式

1 材料與試劑

1.1 實驗動物 Wistar大鼠，體重180～200 g，由大理學院動物實驗中心提供。

1.2 實驗儀器 Finnigan公司LTQ線性離子阱質譜儀，配有離子噴霧離子源以及Xcalibur1.4軟件數據處理系統；Agilent 1100高效液相色譜輸液泵，Agilent 1100自動進樣器；色譜柱為Thermo betabase-18 C18分析柱，I.D.2.1×100 mm，5 mm粒徑，美國Thermo公司。

1.3 試劑 知母皂苷化合物BⅡ（規(guī)格：HPLC≥ 98%）；代謝物M1標準品（薩爾薩皂苷元），購自上海華壹生物科技有限公司；產氣袋、密封袋購自Mitsubishi Gas Chemcal Co.Inc；其他化學試劑：磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸銨、氯化鈣、硫酸鎂、resazurine、L-cysteine、牛肉膏、蛋白胨，以上試劑均為分析純。為天津福晨化學試劑廠和北京化工廠產品。

1.4 實驗方法

1.4.1 厭氧培養(yǎng)液的組成及制備 取37.5 mL溶液A （0.78%K2HPO4）；37.5 mL溶 液 B（0.47% KH2PO4，1.18%NaCl，1.2%（NH4）2SO4，0.12%Ca－Cl2，0.25%MgSO4H2O）；0.1%resazurine 1 mL；L-cysteine 0.5 g；25%L-ascorbic acid 2 mL；8%Na2CO350 mL；牛肉膏1 g；蛋白胨1 g和營養(yǎng)瓊脂1 g；加蒸餾水至1 L；最后調pH 7.5～8.0，其他試劑均為分析純〔2〕。

1.4.2 離體培養(yǎng)腸內菌群對樣品的代謝 取健康大鼠新鮮糞便，按1 g∶4 mL的比例將糞便與生理鹽水混合制成懸濁液，取0.5 mL新鮮配制的糞便懸濁液，加入厭氧培養(yǎng)液4.5 mL，混勻，得到5 mL腸菌培養(yǎng)液。取此新鮮配制的腸菌培養(yǎng)液12份，其中6份各加入樣品5 mg為實驗組。另外6份不加樣品，為空白對照組。置于37℃厭氧培養(yǎng)罐（產氣袋法：將產氣袋打開放入培養(yǎng)袋中就會自動與空氣發(fā)生化學反應產生CO2，在密閉罐內局部造成缺氧環(huán)境，用于腸道厭氧菌培養(yǎng)）中培養(yǎng)，于2、4、8、12、24、36 h取菌群懸液與乙腈按1∶3的比例混合，高速離心10 min，取上清液置高效液相樣品瓶中，40 μL進樣，LC/MS/MS檢測。

1.4.3 大鼠在體腸內菌群對樣品代謝糞便及尿樣采集與處理〔3-4〕Wistar大鼠6只，雌雄各半，大鼠分別置代謝籠中，實驗前禁食12 h，自由飲水，并同時收集空白尿樣和糞樣；按15 mg·kg-1灌胃給予樣品，給藥后兩小時讓大鼠進食。分別收集給藥后0～12、12～24、24～48、48～96 h各時間段的尿樣及糞樣，糞便晾干后研磨混勻，取適量用乙腈浸泡提取過夜。提取液處理同離體菌群懸液。

1.4.4 LC-MS/MS法的分析條件 質譜條件：離子噴射電壓4.5 kV；毛細管電壓44 V；溫度為270℃；鞘氣22 L·min-1；輔助氣5 L·min-1；掃氣2 L·min-1，負離子檢測。掃描方式：選擇反應監(jiān)測（SRM）方式。色譜條件：Thermo betabase-18 C18分析柱，I.D.2.1×100 mm，5 mm粒徑，梯度洗脫方式。流動相：甲醇-乙腈（50：50，v/v），水，流速0.2 mL·min-1，柱溫25℃。流動相梯度變化見表1。

表1 流動相梯度變化

2 實驗結果

2.1 離體培養(yǎng)大鼠腸道菌群對知母甾體皂苷化合物的代謝 LC-MS/MS法分析結果顯示，樣品容易被大鼠腸內菌群代謝。腸內菌懸液與樣品在厭氧狀態(tài)下孵育2 h時，除保留時間為7.9 min的樣品色譜峰外，還出現了保留時間為12.3 min的代謝物，稱之為M1。M1對應的質譜圖顯示（見圖3），其分子離子峰質荷比m/z∶739.7，二級子離子質荷比m/z∶577.6，根據樣品結構推測M1的結構為26位糖鏈脫去并與22位羥基環(huán)合的產物（分子式：C39H64O13結構見圖2）。通過化學手段制備的代謝物M1標準品（經過核磁共振分析確證結構），LC-MS/MS法分析，獲得的總離子色譜圖及二級質譜圖（見圖4）。圖3與圖4對比，保留時間及二級質譜圖幾乎完全一致，佐證M1結構如圖3所示。孵育不同時間腸內菌懸液中樣品和代謝物M1的色譜峰面積變化如表2所示。代謝物M1自孵育2h時即產生，隨后逐漸增多，8 h時峰面積最大，隨后緩慢減少。樣品在孵育2 h時尚有較高濃度，隨后濃度迅速下降，8 h時濃度基本降至谷底。說明樣品經口服給藥后腸道內轉化非常迅速，絕大部分轉化為代謝物M1。

圖2 代謝物M1結構式（C39H64O13）

圖3 腸內菌群懸液中代謝產物總離子色譜圖及M1的對應二級質譜圖

圖4 M1標準品色譜圖及對應二級質譜圖

表2 孵育不同時間腸內菌懸液中樣品和代謝物M1的色譜峰面積變化

圖5 孵育不同時間腸內菌懸液中樣品和代謝物M1色譜峰面積曲線

2.2 在體大鼠腸內菌群對樣品的代謝 大鼠給藥后，分析各個時間段收集的糞便樣品色譜及質譜圖（典型圖譜如圖3），樣品經腸道菌群代謝后，糞便中已無樣品而主要為代謝物M1，與樣品經體外培養(yǎng)的腸道菌群代謝后無明顯差異，質譜圖相似。如圖6所示。

圖6 體外菌群培養(yǎng)2 h后提取離子在30 min飛行時間內代謝物的典型色譜圖及對應質譜圖

由2.1及2.2可知樣品經體外腸道菌群和在體大鼠腸內菌群的代謝產物均為M1，且隨著代謝時間的延長，代謝物M1的量逐漸增多，而甾體皂苷樣品的量則下降迅速。

3 討論

糖類知母甾體皂苷化合物是腸道內細菌重要的碳源，因此，腸道內細菌的苷鍵水解酶系對具有糖苷鍵的藥物進行水解是腸道內細菌代謝的一大特征〔5-6〕。本研究的結果揭示了樣品生物利用度低的原因。樣品經口服給藥后在腸道內即被菌群迅速轉化，主要為代謝物M1。有小部分M1再脫糖的代謝產物，其結構未確定。少量原形被吸收入血，而代謝物M1隨后經糞便排出。色譜圖中代謝物M1為保留時間非常接近的雙峰，雙峰對應的質譜圖顯示分子離子質荷比和子離子質荷比均為739.7及577.6。推測他們是一對結構較為相似的同分異構體。M1是否入血及入血量多少，需再對血樣進行代謝物研究。發(fā)揮樣品藥效學的真正活性分子及腸道內具體代謝菌株尚待進一步研究。

〔1〕李藝，蔣建東.中國藥用天然產物有效成分的代謝研究進展〔J〕.中國中藥雜志，2010，35（23）：3223-3232.

〔2〕張怡紅，李華沖.離體培養(yǎng)人腸道菌群對黃山藥總皂苷的代謝研究〔J〕.中國現代藥物應用，2008，2（14）：6-8.

〔3〕陳新梅.大鼠腸道酶和菌群對人參皂苷Rg1的代謝轉化研究〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2011，17（11）：210-212.

〔4〕徐文，張亞平，張衛(wèi)東，等.離體大鼠腸道菌群對淫羊藿苷的代謝研究〔J〕.世界科學技術：中醫(yī)藥現代化，2006，8（6）：98-106.

〔5〕Akao T，Che Q M，KyoichiK，et al.A Purgative Action of Barbaloin is Induced by Eubacterium sp Strain BAR，a Human Intestinal Anaerobe，Capable of Transforming Barbaloin to Aloeemodin Anthrone〔J〕.Bio Pharm Bull，1996，19（1）：136-138.

〔6〕趙鐘祥，李美芬，林朝展，等.大鼠腸內菌對毛冬青皂苷ilexsaponin A1的代謝轉化〔J〕.中國藥科大學學報，2011，42（4）：329-332.

In Vitro Study of Rat Coliform Bacteria Metabolism of Steroidal Sponin Extract from Anemarrhena asphodeloides

ZHANG Yuzhe
（Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the metabolism of steroidal saponins extracted from Anemarrhena asphodeloides in rat intestinal flora in vitro and to identify the major metabolite.Methods:Rat intestinal flora and steroidal saponins extractions were incubated in vitro, and LC/MS/MS method was used to examine metabolites of steroidal saponins.The urine samples and dungs of the rats were collected after the rats were given with steroidal saponins extract in dose of 15 mg·kg-1by gavage.The metabolites of the steroidal saponins were detected with LC/MS/MS,and the structure of the major metabolite M1 was identified.Meanwhile,the M1 obtained from synthesis was compared with the natural M1 both in vitro and in vivo.Results:In vitro,steroidal saponins extracted from A. asphodeloides were metabolized easily by rat intestinal flora,and the metabolic rate was very quickly,and the major metabolite was M1.The metabolite M1 increased gradually with the prolongation of incubation time,but the quantity of steroidal saponins extract were dropped quickly.Conclusion:Steroidal saponins extracted from A.asphodeloides are metabolized easily by rat intestinal flora.

steroidal saponins;intestinal flora;metabolism;LC/MS/MS

R286.2［文獻標志碼］A［文章編號］1672-2345（2012）03-0005-04

2011-11-18

2012-03-01

張鈺哲，碩士，助教，主要從事藥代及分子藥理學研究.

（責任編輯 毛本勇）