潘利華，劉竹青，于 薈，陳有亮

(浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058)

單核細(xì)胞增生李斯特菌復(fù)合抑菌劑的研究

潘利華，劉竹青，于 薈，陳有亮*

(浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)在0～4℃也能生長(zhǎng)，為確保冷卻肉衛(wèi)生安全，必須阻止肉中污染的LM的生長(zhǎng)繁殖。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究不同抑菌劑對(duì)3株LM的最小抑菌濃度(MIC)，選取了ε－聚賴(lài)氨酸、Nisin、曲酸三種抑菌劑，利用響應(yīng)面法找出最佳組合。結(jié)果表明:ε－聚賴(lài)氨酸、Nisin、曲酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的最小抑菌濃度分別為50μg/mL、200μg/mL、6.4mg/mL。當(dāng)ε－聚賴(lài)氨酸、Nisin、曲酸的濃度分別為20.5μg/mL、184.6μg/mL、4.37mg/mL時(shí)對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑制作用最佳。

ε－聚賴(lài)氨酸，Nisin，曲酸，響應(yīng)面，單增李斯特菌

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一種人畜共患的致病菌，能引起人類(lèi)腦膜炎、敗血癥等疾病，尤其對(duì)孕婦、新生兒、老年人以及免疫功能缺陷者具有較高的感染風(fēng)險(xiǎn)［1］。雖然發(fā)病率不高，但致死率(20%～30%)［2］遠(yuǎn)高于其他常見(jiàn)食源性病原菌。LM已被WHO列為重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的食源性致病菌之一［3］。冷卻肉，是指嚴(yán)格執(zhí)行檢疫制度宰殺后的溫?zé)嵝笕?，?jīng)過(guò)各種方法使其溫度迅速降至0～4℃，并在后續(xù)的分割加工、流通過(guò)程中始終處于0～4℃，不超過(guò)7℃的冷卻鏈控制下的生鮮肉［4］。在冷鏈條件下，酶的活性和大多數(shù)腐敗微生物的生長(zhǎng)受到抑制，與其他微生物不同，LM在0～4℃也能生長(zhǎng)［5］。冷卻肉要想達(dá)到衛(wèi)生安全的目的，必須阻止冷卻肉中污染的LM的生長(zhǎng)繁殖，而添加防腐劑是一種簡(jiǎn)單、有效的方法。目前防腐劑分化學(xué)合成防腐劑和天然防腐劑，但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究發(fā)現(xiàn)，一些合成防腐劑有致癌和致突變等問(wèn)題，因此，開(kāi)發(fā)高效、安全、穩(wěn)定的天然防腐劑成為防腐劑研究的重要方向［6－7］。本實(shí)驗(yàn)研究了ε－聚賴(lài)氨酸、Nisin、曲酸、溶菌酶、乳鐵蛋白、乳酸鈉6種抑菌劑對(duì)3株LM的最小抑菌濃度(MIC)，篩選出3種抑菌效果較好的抑菌劑，對(duì)3種抑菌劑在肉湯中進(jìn)行三元二次旋轉(zhuǎn)回歸實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)響應(yīng)面法找出最佳抑菌劑濃度組合，旨在為其進(jìn)一步在冷卻肉中應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

單增李斯特菌(EGDA、0013、10403S) 浙江大學(xué)動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所提供;培養(yǎng)基 腦心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)干粉培養(yǎng)基;ε－聚賴(lài)氨酸和Nisin 食品級(jí)，浙江銀象生物工程有限公司;乳酸鈉 分析純，上海展云化工有限公司;曲酸 食品級(jí)，成都拉克生物工程有限公司;溶菌酶 食品級(jí)，杭州中香化學(xué)有限公司;乳鐵蛋白 食品級(jí)，南京紐瑞氏食品有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

表2 不同抑菌劑對(duì)單增李斯特菌的MICTable 2 MICs of different bacteriostatic agents against LM

1.2.1 最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定［8］

1.2.1.1 抑菌劑母液的配制及其倍比稀釋 抑菌劑母液的配制:用無(wú)菌蒸餾水配制12.8mg/mL的Nisin、溶菌酶、ε－多聚賴(lài)氨酸、乳鐵蛋白;配制25.6mg/mL的曲酸和乳酸鈉，搖勻，放于冰箱備用。

倍比稀釋:將抑菌劑母液用無(wú)菌水以1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048倍稀釋。

1.2.1.2 菌懸液的制備 取細(xì)菌37℃搖床培養(yǎng)10～12h。用 BHI液體培養(yǎng)基調(diào)整濃度至108CFU/mL (OD600=0.15)，將菌液稀釋至107CFU/mL，振蕩混勻，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 MIC的測(cè)定 將倍比稀釋后不同濃度的抑菌液分別加到無(wú)菌的96孔酶標(biāo)板中，第1至第11孔加抑菌液，每孔加100μL，第12孔不加抑菌液作對(duì)照組，再向每孔中加100μL制備的菌懸液，密封后置37℃培養(yǎng)。用酶標(biāo)儀從0h開(kāi)始每隔2h測(cè)量菌液的OD630，檢測(cè)至第12h。做OD－t生長(zhǎng)曲線，通過(guò)觀察曲線，以單增李斯特菌不生長(zhǎng)的最低濃度為MIC。

1.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 菌懸液的制備 取三株單增李斯特菌(10403S、EGD、0013)37℃過(guò)夜培養(yǎng)物，調(diào)整菌液濃度至108CFU/mL(OD600=0.15)，將三株單增李斯特菌振蕩均勻，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 按照三元二次回歸通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)添加ε－多聚賴(lài)氨酸、Nisin和曲酸的用量，實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，共21組實(shí)驗(yàn)。然后取制備好的菌液分裝于各組試管，每個(gè)試管50μL，最后用BHI營(yíng)養(yǎng)肉湯補(bǔ)足5mL，初始菌液濃度為106CFU/mL。將試管于10℃下冷藏放置5d，從0d起，每天每組取2個(gè)試管進(jìn)行計(jì)數(shù)。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels of RAS test

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 所得數(shù)據(jù)用SAS軟件(8.2版)進(jìn)行分析，擬合出模型，并通過(guò)降維分析各因素間的交互作用［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抑菌劑對(duì)單增李斯特菌的MIC

不同抑菌劑對(duì)單增李斯特菌的MIC見(jiàn)表2。由表2可知，抑菌效果最好的是ε－聚賴(lài)氨酸，對(duì)3株單增李斯特菌的MIC均為50μg/mL，抑菌效果次之的是Nisin和曲酸，其MIC分別為200和6400μg/mL以下。而乳酸鈉、溶菌酶、乳鐵蛋白的抑菌效果不明顯。本實(shí)驗(yàn)中，雖然ε－聚賴(lài)氨酸和Nisin的抑菌效果較好，但是ε－聚賴(lài)氨酸和Nisin的價(jià)格較高，曲酸價(jià)格便宜，因此，選取ε－聚賴(lài)氨酸、Nisin和曲酸作為回歸實(shí)驗(yàn)的抑菌劑，以期得到復(fù)合抑菌劑。

2.2 各組5d內(nèi)菌落總數(shù)的變化

對(duì)在10℃下冷藏的21組BHI營(yíng)養(yǎng)肉湯以5d為周期進(jìn)行菌落總數(shù)的檢測(cè)，其中第21組為對(duì)照組，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出，除第13處理組是緩慢增長(zhǎng)外，其他處理組單增李斯特菌的生長(zhǎng)基本都被抑制，第8組是菌數(shù)降低最快的一組。對(duì)照組明顯增加，菌落總數(shù)從106CFU/mL增長(zhǎng)到109CFU/mL。

2.3 三元二次回歸通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

三元二次回歸通用旋轉(zhuǎn)組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及第3d菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值如表4所示。

表4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Experimental design and results

2.3.1 回歸模型與統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn) 用SAS(8.2版)軟件的RSREG過(guò)程對(duì)表4中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析。所得二次回歸方程:

表3 各組在10℃下冷藏5d內(nèi)菌落總數(shù)的變化(CFU/mL)Table 3 Changes in total bacteria counts of 21 samples stored at 10℃(CFU/mL)

為了說(shuō)明模型的有效性和各因素對(duì)抑菌效果影響的重要程度，對(duì)二次回歸方程模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5。由方差分析表可知，失擬項(xiàng)的F=0.78，P=0.6029＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明未知因子對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾很小;回歸模型的F=25.62，P＜0.0001，表明回歸方程模型極顯著，說(shuō)明該模型與實(shí)際情況擬合效果很好，可以正確反映菌落數(shù)與ε－聚賴(lài)氨酸、Nisin、曲酸三因素間的關(guān)系。為了說(shuō)明各因素對(duì)抑菌效果的貢獻(xiàn)大小，對(duì)各偏回歸系數(shù)進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6。表6表明，在編碼區(qū)間內(nèi)，Nisin、曲酸的添加量對(duì)菌落數(shù)有極顯著影響，ε－聚賴(lài)氨酸的添加量對(duì)菌落數(shù)無(wú)顯著影響，但ε－聚賴(lài)氨酸和Nisin添加量的交互項(xiàng)對(duì)菌落數(shù)有顯著影響。

表5 回歸模型方差分析表Table 5 ANOVA for quadratic model

2.3.2 單因子效應(yīng)分析 觀察某因子變化對(duì)Y值的影響，可采用降維分析的方法，將其它因子固定在0水平，3個(gè)因子的單因子效應(yīng)方程如下:

根據(jù)以上方程，可得到單因子效應(yīng)曲線如圖1所示。

表6 回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table 6 Significance test of regression coefficient

由圖1可知，當(dāng)X1編碼為+0.55，即ε－聚賴(lài)氨酸添加量為33.2μg/mL;X2編碼為+1.682，即Nisin添加量為200μg/mL;X3編碼為+1.18，即曲酸添加量為5.12mg/mL，菌落總數(shù)分別為極小值。在取得極小值之前，菌落總數(shù)與防腐劑的百分比均為負(fù)相關(guān);取得最小值之后，菌落總數(shù)與防腐劑的百分比均為正相關(guān)。

圖1 單因子效應(yīng)曲線Fig.1 Effect of single factor on the colony count

2.3.3 交互效應(yīng)分析 采用降維分析，令某因素水平值為0，就可以得到其他兩個(gè)因素對(duì)菌落數(shù)的二元二次方程。根據(jù)回歸方程繪制ε－聚賴(lài)氨酸、Nisin、曲酸3個(gè)因素對(duì)菌落數(shù)Y影響的響應(yīng)面圖，見(jiàn)圖2～圖4。

圖2 ε－聚賴(lài)氨酸和Nisin的響應(yīng)面曲線Fig.2 The response surface of ε－polylysine and Nisin

圖3 ε－聚賴(lài)氨酸和曲酸的響應(yīng)面曲線Fig.3 The response surface of ε－polylysine and kojic acid

圖4 Nisin和曲酸的響應(yīng)面曲線Fig.4 The response surface of Nisin and kojic acid

響應(yīng)面圖可反映響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件改變的敏感性，從另一個(gè)方面也說(shuō)明因素間交互作用的強(qiáng)弱。由圖2～圖4可知ε－聚賴(lài)氨酸和Nisin的之間交互作用相對(duì)于其他因素之間的交互作用最大，而ε－聚賴(lài)氨酸和曲酸之間的交互作用最小。

2.3.4 最佳配比的確定 為確定各因素的最佳取值，利用SAS軟件進(jìn)行嶺脊分析［10］，根據(jù)分析可得菌落總數(shù)得到最低水平時(shí)3種抑菌劑的各自編碼值，即X1=－0.30，X2=1.41，X3=0.76。換算成實(shí)際值，即當(dāng)聚賴(lài)氨酸添加量為 20.5μg/mL，Nisin添加量為184.6μg/mL，曲酸添加量4.37mg/mL時(shí)，單增李斯特菌的對(duì)數(shù)值可達(dá)最小值1.95，此時(shí)抑菌效果最佳。

3 討論

3.1 不同抑菌劑對(duì)單增李斯特菌的MIC

本實(shí)驗(yàn)中，抑菌效果最好的是ε－聚賴(lài)氨酸，對(duì)3株單增李斯特菌的MIC均為50μg/mL，抑菌效果次之的是Nisin和曲酸，而乳酸鈉、溶菌酶、乳鐵蛋白的抑菌效果不明顯。倪清艷［11］等人采用牛津杯法和平板稀釋法測(cè)定了ε－多聚賴(lài)氨酸對(duì)常見(jiàn)菌的抑菌特性;探討了其經(jīng)高溫處理后及與其它防腐劑復(fù)合后的抑菌特性，結(jié)果顯示，ε－多聚賴(lài)氨酸對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌的最小抑菌濃度分別為40、45、450mg/L;不同溫度處理后的抑菌效果基本沒(méi)有變化。說(shuō)明其具有較好的熱穩(wěn)定性能。郭良輝［12］等人研究了Nisin與溶菌酶復(fù)合生物保鮮劑對(duì)蚌肉的保鮮效果，通過(guò)對(duì)感官指標(biāo)、揮發(fā)性鹽基氮和細(xì)菌總數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行考察，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，溶菌酶和Nisin等對(duì)蚌肉的防腐保鮮效果都好于對(duì)照組，而且Nisin與溶菌酶復(fù)配后效果更好，從實(shí)驗(yàn)中還得出Nisin具有一定的抑制脂肪酸敗的效果。蘇國(guó)成［13］等人針對(duì)曲酸對(duì)于食品中常見(jiàn)污染菌的抑制作用進(jìn)行系統(tǒng)研究，確定了曲酸對(duì)各種供試菌最小抑菌濃度，即曲酸對(duì)大腸桿菌、豬傷寒沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌和啤酒酵母菌的MIC分別是0.3%、0.4%、0.2%、0.4%、0.2%和0.5%。國(guó)內(nèi)外關(guān)于ε－聚賴(lài)氨酸、Nisin、曲酸、乳酸鈉、溶菌酶、乳鐵蛋白針對(duì)單增李斯特菌的MIC的文獻(xiàn)報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)明確了不同抑菌劑對(duì)單增李斯特菌的MIC。

3.2 復(fù)合抑菌劑對(duì)單增李斯特菌的影響

加了抑菌劑的各組BHI營(yíng)養(yǎng)肉湯，其微生物的生長(zhǎng)基本受到抑制，而未加抑菌劑的對(duì)照組，微生物數(shù)明顯增加，從106CFU/mL增長(zhǎng)到109CFU/mL。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的處理對(duì)單增李斯特菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制效果，可為進(jìn)一步在冷卻肉中應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

以菌落總數(shù)作為指標(biāo)來(lái)看各抑菌劑的抑菌效果，結(jié)果依次是曲酸、Nisin和ε－聚賴(lài)氨酸。說(shuō)明在編碼區(qū)間內(nèi)，曲酸的添加量對(duì)抑菌效果的影響最為顯著。1947年，Mattick和Hirsch證明Nisin可抑制許多革蘭氏陽(yáng)性菌［14］，本實(shí)驗(yàn)中，單增李斯特菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，Nisin對(duì)其抑制效果達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，這與前人的報(bào)道相一致。李鳳梅［15］采用圓濾紙片法研究曲酸與ε－聚賴(lài)氨酸復(fù)合抑菌效果。結(jié)果顯示，復(fù)合后對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果具有協(xié)同增效作用。本實(shí)驗(yàn)中，從ε－聚賴(lài)氨酸與曲酸的響應(yīng)曲面圖可知，兩者的交互作用顯著。

4 結(jié)論

4.1 抑菌效果最好的是ε－聚賴(lài)氨酸，對(duì)3株單增李斯特菌的MIC均為50μg/mL，抑菌效果次之的是Nisin和曲酸，其MIC分別為200和6400μg/mL以下。

4.2 當(dāng)ε－聚賴(lài)氨酸添加量為20.5μg/mL，Nisin添加量為184.6μg/mL，曲酸添加量4.37mg/mL時(shí)，對(duì)數(shù)值可到達(dá)最小值1.95，此時(shí)抑菌效果為最佳。ε－聚賴(lài)氨酸和Nisin有交互作用。

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Study on composite antibacterial agents for Listeria monocytogenes

PAN Li－h(huán)ua，LIU Zhu－qing，YU Hui，CHEN You－liang*
(College of Animal Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China)

We had to prevent the growth and proliferation of LM which contaminated the meat to ensure the safety of chilled meat，as Listeria monocytogenes can grow at 0～4℃.We studied the minimum inhibitory concentration(MIC) of different bacteriostatic agents against LM，selected ε－polylysine，Nisin and kojic acid，and found their best combination by response surface method.The results showed that the MIC of ε－polylysine，Nisin，kojic acid against LM was 50μg/mL，200μg/mL and 6.4mg/mL.The best bacteriostatic effect of LM under the concentration of ε－polylysine，Nisin，kojic acid was 20.5μg/mL，184.6μg/mL and 4.37mg/mL.

ε－polylysine;Nisin;kojic acid;response surface;Listeria monocytogenes

TS202.3

A

1002－0306(2012)08－0344－05

2011－08－12 *通訊聯(lián)系人

潘利華(1987－)，女，碩士，研究方向:食品安全。

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2009BADB09－5)。