張 忠，鄭小義，畢 陽，王 義，徐 建

(甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070)

南瓜皮提取物的體外抑菌活性

張 忠，鄭小義，畢 陽*，王 義，徐 建

(甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070)

為了揭示南瓜較長貯存期與其皮部活性物質(zhì)功能之間的關(guān)系，通過使用石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、水5種不同極性強度的溶劑對南瓜皮進行連續(xù)梯度提取，采用孢子萌發(fā)抑制法、瓊脂孔擴散法和對倍稀釋法測定了不同提取物對5種真菌:擴展青霉(Penicillium expansum)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、黑根霉(Rhizopus stolonifer)、互格交鏈孢(Alternaria alternate)和粉紅單端孢(Trichothecium roseum)和5種細菌:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃葡萄球菌(Staphylicoccus aureus)、熒光假單孢桿菌(Pseudomonas fluorescence)和乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的抑菌活性和最低抑菌濃度;并用掃描電鏡觀察了水提取物對菌體形態(tài)的影響。結(jié)果表明:除石油醚提取物外，四種提取物對供試菌有不同程度的抑制活性，其中水提取物的抑菌活性最強，水提取物處理使菌體外表形態(tài)發(fā)生明顯的傷害性變化。初步說明南瓜皮中的預存抗菌物質(zhì)是有助于南瓜較長貯存期的一個因素。

南瓜，外果皮提取物，抑菌活性，瓊脂孔擴散法，最低抑菌濃度

南瓜是我國主要的經(jīng)濟作物之一，種植面積大、品種多、總產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的1/3左右［1］。南瓜果實保藏期較長，表面完好的可保存半年以上，但表皮受損后保藏期則大大縮短［2］。盡管南瓜的諸多營養(yǎng)保健功能早己為人們所熟知，但有關(guān)南瓜中天然抗菌活性成分的報道不多。南瓜的長貯存性長期以來被認為與其外表皮的高度木質(zhì)化和其內(nèi)的天然抗菌物質(zhì)有關(guān)，并分離出一個與木質(zhì)素代謝密切關(guān)聯(lián)的抗菌物質(zhì)反式香豆醛［3］。Wang等發(fā)現(xiàn)南瓜籽中存在一種富含精氨酸，谷氨酰胺和甘氨酸的抗菌肽［4］。Alice等的研究對南瓜籽中抗菌蛋白質(zhì)進行了純化［5］，江英等對南瓜果肉的抗菌性進行了研究［6］。Park等從黃皮南瓜皮中分離到一種分子量為14ku的抗菌蛋白，該蛋白對Botrytis cinerea，Colletotrichum coccodes等5種真菌病原菌在體外具有抑制活性［7］。但是對我國主產(chǎn)的綠皮南瓜大磨盤的各種皮提取物和對一些果蔬腐敗菌的抗性的研究未見報道。本研究采用4種有機溶劑和水對南瓜皮活性物質(zhì)進行提取和分離，測定各種提取物對5種采后真菌以及5種腐敗細菌在體外條件下的抑制效果，并通過掃描電鏡觀察有效提取物處理對部分供試菌形態(tài)結(jié)構(gòu)方面的影響，為南瓜的長貯存期和皮部活性物質(zhì)的抗菌作用提供部分科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試南瓜 品種:大磨盤，采自甘肅省民勤縣收成鄉(xiāng)露天大田，網(wǎng)袋包裝后運抵本校實驗室，于室溫(20±5)℃下貯藏待用;擴展青霉菌(Penicillium expansum)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、黑根霉(Rhizopus stolonifer)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)CICC10032、金黃葡萄球菌(Staphylicoccus aureus)CMCC26003、熒光假單孢桿菌(Pseudomonas fluorescence)AS10235、乳酸菌(Lactobacillus plantarum) 由廣東微生物研究所購得并在本院采后生物學實驗室保藏;互格交鏈孢(Alternaria alternate)和粉紅單端孢(Trichothecium roseum) 由本院采后生物學實驗室從發(fā)病果實分離保藏。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 參照董周永［8］方法并修改。先將南瓜用自來水沖洗干凈，自然晾干后取1～5mm厚的果皮及皮下組織，在－70℃，0.08MPa條件下(Clean V2C8真空凍干機)凍干48h后用粉碎機粉碎，過40目篩，用PE袋(17cm×12cm)包裝，于0℃冰箱中貯藏待用。

1.2.2 提取物制備 參照馮俊濤［9］的方法并修改。取低溫儲存的南瓜皮粉100g放入到500mL的具塞三角瓶中，采用石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、純水5種提取液3倍量體積從低極性到高極性的逐級提取的方法。用錫箔紙封住瓶口，置于30℃，120r/min的搖床上振蕩浸提，每3h過濾，濾渣用相同溶劑重復提取4次，合并相同溶劑提取液。減壓濃縮后用原溶劑定容至100mL，得到5種質(zhì)量濃度為1g/mL的提取液，并分別根據(jù)提取溶劑標記為PE，EE，AE，ME和WE。

1.2.3 菌體細胞懸浮液的配制 參照Bi［10］的方法。取25℃下培養(yǎng)10d的帶菌PDA平皿一個，加入含0.5%(v/v)Tween20的無菌水約10mL，用玻璃棒刮下平板上的病原菌孢子，然后轉(zhuǎn)入50mL三角瓶中，在WYX－A微型旋渦混合器上振蕩15s，再用雙層紗布過濾，濾液用血球計數(shù)板計數(shù)算出孢子懸浮液的濃度，最后稀釋至所需濃度1×106CFU/mL。細菌菌懸液的制備采用平板菌落計數(shù)法［11］，菌體濃度為5× 106CFU/mL。

1.2.4 真菌孢子萌發(fā)率測定 參照潘金菊［12］的方法并修改。將4個直徑1cm的瓊脂塊放在同一滅菌載玻片上。在每個瓊脂塊表面加入10μL的供試孢子懸浮液，其中兩個再添加10μL含2%(v/v)二甲亞砜的南瓜皮提取液，另外兩個分別添加10μL含2% (v/v)二甲亞砜的相應提取溶劑作對照，將載玻片置于飽和濕度的平皿中，在28℃下培養(yǎng)1h后開始進行顯微觀察并用計數(shù)器記數(shù)，每隔1h計數(shù)1次，實驗重復三次，計算萌發(fā)率。

1.2.5 瓊脂孔擴散法抑菌活性測定 參照 Cakir［13］的方法并修改。在無菌條件下，將高壓滅菌的瓊脂培養(yǎng)基(細菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌用PDA培養(yǎng)基)趁液態(tài)倒入干燥滅菌的直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，厚度約為4mm，待培養(yǎng)基冷凝后，加入0.1mL菌懸液并均勻涂布平板，然后用無菌金屬打孔器(d=6mm)在培養(yǎng)基中心打小孔1個，用無菌牙簽除去孔內(nèi)瓊脂，并用移液槍吸取一滴液體瓊脂封底。分別吸取不同的南瓜皮提取物0.2mL加入孔內(nèi)，并用各自的提取溶劑作空白對照。然后將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(細菌于37℃培養(yǎng)18～24h，真菌于28℃培養(yǎng)48～96h)。后用十字交叉法測量有效抑菌圈直徑(簡稱抑菌圈直徑)，實驗重復三次。

1.2.6 最低抑菌濃度(MIC)的測定 參照楊華明［14］的方法。取8支無菌小試管，于第1～8管中各加入培養(yǎng)基(細菌用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，霉菌用PDA液體培養(yǎng)基)1mL。取南瓜皮不同提取液1mL加入第1管中，混勻后取1mL加入第2管，依次倍比稀釋，自第7管吸去1mL棄去，第8管作為空白對照。然后在各管中加入事先制備好的菌懸液20μL，混勻后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(細菌置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，霉菌置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～96h)。觀察試管澄清度，若液體培養(yǎng)基混濁，表示菌體生長，若液體培養(yǎng)基完全清亮，表示無菌體生長。無菌體生長的最小濃度即為最小抑菌濃度。實驗重復三次。

1.2.7 水提取物對A.alternata和P.fluorescence菌體形態(tài)的研究 為了研究南瓜皮抑菌活性物質(zhì)作用于供試菌后其菌體表面形態(tài)的變化情況，選擇抑菌效果最好的提取物，掃描電鏡觀察在相應最低抑菌濃度處理后其對最為敏感的真菌 A.alternata和細菌P.fluorescence的菌體形態(tài)的影響。

參照高向陽［15］的方法。取處理的菌絲及對照菌絲若干，在4℃冰箱中用2%(v/v)戊二醛固定2h，磷酸緩沖溶液洗3次，每次10min;再浸泡于1%(v/v)的鋨酸溶液中，4℃下放置2h左右;用50%、70%、95%、100%(v/v)的系列乙醇各脫水10min。醋酸異戊酯置換20min。以上各步驟均在4℃下進行，臨界點干燥，真空鍍金。掃描電鏡觀察并采集照片。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 用Origin8.0處理數(shù)據(jù)計算標準偏差并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取物對真菌孢子萌發(fā)率的影響

處理后第6h各真菌孢子的萌發(fā)率(圖1)表現(xiàn)出了明顯的差異。南瓜皮水提取物處理使真菌孢子萌發(fā)率整體上降低最明顯，其中 F.oxysporum 和A.alternate僅萌發(fā)1/3左右。石油醚提取物對孢子萌發(fā)影響最小。A.alternata對水提取物最為敏感，而在丙酮提取物和石油醚提取物的處理下孢子萌發(fā)率最高。R.stolonifer對各種提取物的敏感程度最低，僅水提取物處理下萌發(fā)率為56%，其余各處理下萌發(fā)率均高于89.7%。說明水提取物整體上對抑制孢子萌發(fā)最有效，而A.alternate和F.oxysporum對各提取物整體上最敏感。

表1 不同提取物對供試菌的最低抑菌濃度Table 1 Minimum inhibitory concentrations of various extracts to bioassay microbes

圖1 不同提取物對真菌孢子萌發(fā)率的影響Fig.1 Effect of various extracts on the germination ratio of bioassay fungi

2.2 不同提取物對供試真菌的抑菌效果

從處理后培養(yǎng)96h時各提取物對不同真菌的抑菌圈看(圖2)，南瓜皮水提取物在抑制真菌菌落生長方面最有效，其次是甲醇提取物和乙酸乙酯提取物，但甲醇提取物能抑制四種菌的生長而乙酸乙酯提取物僅抑制三種菌的生長。水提取物對A.alternata的抑菌圈直徑達4.27cm，對F.oxysporum的抑菌圈直徑也達3.85cm。另外水提取物對其它三種真菌的抑菌圈也達到或超過3.35cm。甲醇提取物和乙酸乙酯提取物對有效菌的抑菌圈直徑都超過1.3cm。石油醚提取物和丙酮提取物對供試真菌的菌落生長無抑制效果。

圖2 各提取物對不同真菌的抑菌圈直徑Fig.2 Inhibition zone diameter of various extracts to bioassay fungi

2.3 不同提取物對供試細菌的抑菌效果

不同提取物處理供試細菌后培養(yǎng)48h的抑菌圈直徑的大小(圖3)表明，除石油醚提取物外，其余每種南瓜皮提取物至少對兩種以上的細菌菌落生長有抑制效果。其中水提取物的抑制效果整體上最為明顯且能抑制五種供試菌，該提取物對S.aureus的抑菌圈達3.33cm;對其它四種細菌的抑菌圈直徑也都在2.52cm以上。甲醇提取物對細菌的抑制活性次之，它對S.aureus的抑菌圈直徑達2.87cm，對其余三種菌的抑菌圈直徑也在1.33cm以上。乙酸乙酯提取物和丙酮提取物抑制細菌生長的活性也較強，對有效菌的抑菌圈直徑都在1.22cm以上。

圖3 各提取物對不同細菌的抑菌圈直徑Fig.3 Inhibition zone diameter of various extracts to bioassay bacteria

2.4 不同提取物對供試菌的最低抑菌濃度

最低抑菌濃度(MIC)定量地表示了抑菌物質(zhì)抑菌活性的強弱。南瓜皮各種提取物對供試菌的MIC值(表1)中水提取物對各種菌的MIC普遍較低，對A.alternata和P.fluorescence的MIC為15.6mg/mL。除對P.expansum和F.oxysporum的MIC為62.5mg/mL外，對其余菌的MIC均為31.25mg/mL。甲醇提取物對S.aureus的MIC和乙酸乙酯提取物對B.subtilis的MIC都為15.6mg/mL。從MIC值可知水提取物整體上對各種菌的抑制活性最強。

2.5 水提取物對A.alternata和P.fluorescence形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.5.1 水提取物對A.alternata形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 南瓜皮水提取物最低抑菌濃度處理A.alternata后菌絲的表面形態(tài)發(fā)生了明顯的傷害性變化(圖4)。掃描電鏡觀察到對照(C1和C2)的菌絲呈規(guī)則的線形結(jié)構(gòu);分生頭部發(fā)育良好，光滑壁厚，基部較健壯;菌絲串規(guī)則，局部形態(tài)呈線形。而且菌絲直徑穩(wěn)定，基本為單列，均一，表面光滑的健壯菌絲。相比較處理(T1和T2)后的菌絲分生頭部發(fā)生明顯的變形，表面粗糙畸形、出現(xiàn)凸狀小點。另外分生頭部也觀察到一些明顯的破裂和完整性的缺失。大部分菌絲的線形形態(tài)被破壞，外形皺曲萎縮，粗細不均，菌絲串混亂無序，集結(jié)消退。菌絲萌發(fā)較少，發(fā)生了明顯的畸形，局部不規(guī)則膨脹。出現(xiàn)了較多的扁平空菌絲和崩潰菌絲。處理后菌絲形態(tài)的微觀特征變化與整體菌落邊緣近藥物端的宏觀形態(tài)的特征是一致的。

圖4 掃描電鏡觀察南瓜皮水提取物最低抑菌濃度處理后的A.alternata菌絲形態(tài)(T1和T2)與對照(C1和C2)Fig.4 Morphological comparison under scan electron microscope of A.alternate hyphae treated with WE at MIC (T1 and T2)and counterpart control(C1 and C2)

2.5.2 水提取液對P.fluorescence形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響南瓜皮水提取物處理后P.fluorescence菌體形態(tài)發(fā)生的傷害性變化(圖5)。從掃描電鏡觀察到對照(C1和C2)的菌體細胞完整，表面光滑，菌體細長，呈均勻的節(jié)狀。菌體之間有序束狀排列，健壯茂密。而水提取物處理(T1和T2)后的菌體外在形態(tài)發(fā)生明顯的傷害性變化，菌體的細胞完整性遭到很大破壞，出現(xiàn)較多的細胞碎片。細胞外壁粗糙，出現(xiàn)明顯的變形和崩潰。菌體萎縮退化，排列混亂。處理后菌體的微觀形態(tài)變化和處理后出現(xiàn)較大的抑菌圈的宏觀生物學現(xiàn)象相一致。

3 討論與結(jié)論

不同溶劑提取物對供試菌的生長抑制能力和抑菌譜不同。根據(jù)相似相容原理，可以初步判定各類提取物的極性特征。從較低極性的石油醚提取物到較高極性的水提取物，不同極性提取物表現(xiàn)出了不同的抑菌活性。低極性的石油醚提取物對各種供試菌都無抑制活性，而水提取物的抑菌活性最高，但是在本實驗中，丙酮提取物的抑菌活性整體上也較低。從活性的極性分布范圍來說，在本研究體系中，表現(xiàn)活性的并非單一的某種物質(zhì)，這一點可從丙酮提取物對供試真菌沒有抑制活性得到驗證。在高極性的甲醇和水提取物中存在著一些黃酮類、固醇類、多酚和單寧［16］。而大多數(shù)被研究植物中，酚類和單寧類是主要的抗菌物質(zhì)［17］。在水提取物中，酚類與大分子的蛋白質(zhì)結(jié)合成復合體，作用于微生物表面的氧化還原酶系，抑制了微生物細胞表面的一些受體，進而抑制了微生物的生長［18］。南瓜皮部分提取物的抑菌圈大小與其相應的最低抑菌濃度未完全成對應關(guān)系，左國營［19］的研究也得到了類似的結(jié)論，這可能與提取物在不同介質(zhì)中的分散性有關(guān)。

圖5 掃描電鏡觀察南瓜皮水提取物最低抑菌濃度處理后的P.fluorescence菌體形態(tài)(T1和T2)與對照(C1和C2)Fig.5 Morphological comparison under scan electron microscope of P.fluorescence cells treated with WE at MIC(T1 and T2)and counterpart control(C1and C2)

真菌和細菌對各種提取物的敏感程度也表現(xiàn)出了相似性。兩類菌都對石油醚提取物不敏感，其次是對丙酮提取物敏感性整體上也較差。供試細菌中，格蘭氏陽性菌和陰性菌對提取物的敏感性沒有表現(xiàn)出規(guī)律性，這也說明有效提取物可能是作用于菌的非細胞壁部位［20］。掃描電鏡觀察顯示南瓜皮水提取物處理造成菌體形態(tài)特征發(fā)生許多傷害性的變化，這可能是菌體膜表面某些酶蛋白受到提取物活性分子的攻擊而造成了連鎖性的代謝紊亂有關(guān)［21］。

本研究表明南瓜皮乙酸乙酯，丙酮，甲醇和水提取物對P.expansum，F(xiàn).oxysporum，R.stolonifer，T，roseum和 A.alternate 5 種 真 菌 與 E.coli，S.aureus，P.fluorescence，L.plantarum和B.subtilis 5種細菌的生長都有不同程度的抑制作用。其中水提取物對10種供試菌的抑制效果最好;甲醇提取物的抑制效果次之，對9種供試菌有抑制作用;依次是乙酸乙酯提取物，對6種菌有抑制作用;丙酮提取物，僅對3種供試細菌有抑制作用;石油醚提取物則對10種供試菌均無抑制作用。這些提取物中存在的活性抑菌分子可能與南瓜的長貯存期和抗病性有關(guān)。

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In vitro antimicrobial activity of extracts from autumn squash rind

ZHANG Zhong，ZHENG Xiao－yi，BI Yang*，WANG Yi，XU Jian
(College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China)

To explore the possible relevance between the long safe storage period of autumn squash and the contribution of its rind bioactive substances，petroleum ether，ethyl acetate，acetone，methanol and water were used to conduct a subsequent polarity gradient extraction on autumn squash rind.The activity of various extracts and their minimum inhibitory concentrations(MIC)against five fungi(Penicillium expansum，F(xiàn)usarium oxysporum，Rhizopus stolonifer，Alternaria alternate and Trichothecium roseum)and five bacteria(Bacillus subtilis，Escherichia coli，Staphylicoccus aureus，Pseudomonas fluorescence and Lactobacillus plantarum)were evaluated based on the methods of spore germination counting，agar well diffusion and double dilution.The modification on strain morphology ensuing the aqueous extract treatment at MIC was also investigated through electron scanning microscope.Results showed that all extracts but the one of petroleum ether displayed some inhibition capabilities on the growth of bioassay microbes and among them the strongest was the aqueous extract.Obvious detrimental alteration was observed on the cells or mycelium surface after aqueous extract treatment.Preliminary suggestion was that phytoalexin in the extracts from the rind was contributed to the long storage period of autumn squash.

autumn squash;rind extract;antimicrobial activity;agar well diffusion method;minimum inhibitory concentration(MIC)

TS255.1

A

1002－0306(2012)08－0128－05

2011－08－15 *通訊聯(lián)系人

張忠(1977－)，男，講師，碩士，主要從事天然抗菌活性物質(zhì)的研究。

國家自然科學基金面上項目(30671465)。