源博恩，趙強忠，趙謀明

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

酸性條件下高壓均質(zhì)對大豆蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性的影響

源博恩，趙強忠，趙謀明*

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

通過還原電泳、粒度分布以及內(nèi)源熒光掃描光譜等手段研究了酸性條件(pH3.0)下高壓均質(zhì)處理對大豆蛋白結(jié)構(gòu)的影響，并測定了改性樣品功能特性的變化。結(jié)果表明，酸性條件下高壓均質(zhì)對大豆蛋白亞基組成影響較小。隨著均質(zhì)壓力的上升，改性樣品的粒徑呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢，在40MPa時達到最大值，為94.33nm;而內(nèi)源掃描最大吸收波長λmax也呈現(xiàn)先增大后下降的過程，表明大豆蛋白結(jié)構(gòu)先展開后聚集，在20MPa時，其λmax為336.0nm，展開程度達到最大。功能特性方面，均值壓力為20MPa時能有效改善大豆蛋白的溶解性;其乳濁液的粒徑隨著均質(zhì)壓力的增大而不斷下降。

大豆蛋白，酸處理，高壓均質(zhì)，結(jié)構(gòu)，功能特性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂豆粕 山東禹王實業(yè)有限公司產(chǎn)品，蛋白質(zhì)含量(質(zhì)量分數(shù))為47.86%;牛血清蛋白(BSA) Sigma Fitzgerald公司產(chǎn)品;其它試劑 為分析純。

高壓均質(zhì)機 丹麥APV公司;SP－721可見分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司;pHS－25數(shù)顯pH計 瑞士梅特勒－托利多公司;電泳槽 北京六一儀器廠;F7000熒光分光光度計 日本日立公司; Nano－ZS＆MPT－2Zeta電位及納米粒度分布儀 英國Malvern公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸解離－均質(zhì)樣品制備 樣品的制備過程。豆粕與去離子水按1∶15(w/w)的比例混合，用2mol/L的NaOH調(diào)節(jié) pH至7.5，浸提1h后，8000×g離心20min去除殘渣，以1mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至4.5，酸沉后8000×g離心20min，所得沉淀加5倍(w/w)去離子水復溶，分散均勻之后，平均分成六等份，其中一份用1mol/L NaOH調(diào)至pH 7.0，用去離子水透析，然后凍干得到SPI。另外五份用1mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至3.0，并穩(wěn)定2h。其中一份用1mol/L的NaOH調(diào)至pH7.0，用去離子水透析，然后凍干得到AT;另外四份分別使用20、40、60、80MPa進行均質(zhì)處理，處理后用1mol/L的NaOH調(diào)至pH 7.0，用去離子水透析，然后凍干得到A－HPH20、A－HPH40、A－HPH60和A－HPH80。

1.2.2 十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE) 參照LaemmLi方法［5］。分離膠濃度為12%(質(zhì)量分數(shù)，下同)，濃縮膠濃度為5%。電泳前將已和樣品緩沖液混合的樣品煮沸5min，上樣量為10μL，凝膠電泳于恒流下進行，在濃縮膠中電流為40mA，進入分離膠后增至80mA。凝膠染色及脫色后，于凝膠成像系統(tǒng)進行成像處理。

1.2.3 熒光光譜分析 采用F－7000熒光分光光度計測定各樣品的熒光光譜［6］。樣品的質(zhì)量濃度為0.10g/L，熒光發(fā)散光譜分析以蛋白質(zhì)內(nèi)部熒光基團為探針，熒光光譜在290nm激發(fā)，掃描波長為300～400nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5nm，電壓為500mV。1.2.4 粒度測定 將1mg/mL的樣品溶液用0.2mol/L的NaOH調(diào)至pH7.0，室溫下攪拌并穩(wěn)定1h。根據(jù)Zhang［7］的方法，采用激光納米粒度測定儀進行粒度測定。

1.2.5 溶解性的測定 將1%的樣品溶液用0.2mol/L的NaOH調(diào)至pH7.0，振蕩10min，然后離心(10000×g，20min)，上清液中的蛋白質(zhì)采用Lowry法［8］測定，利用BSA做標準曲線，測定500nm處的吸光值。根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)含量和溶液中蛋白質(zhì)含量比值計算溶解度。1.2.6 乳化特性的測定 將各樣品配成質(zhì)量分數(shù)為2%的溶液，加入體積分數(shù)為20%的玉米油，30MPa高壓均質(zhì)1次，制成乳狀液，于常溫靜置24h，按質(zhì)量比1∶1000用去離子水稀釋，采用粒度分布儀測定乳狀液中粒子大小及其分布［9］。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 數(shù)據(jù)均為三次測定的平均值，并使用Excel2003作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 改性樣品的SDS－PAGE電泳分析

從SDS－PAGE電泳圖 1可以看出，酸處理(pH3.0)以及在酸性條件下經(jīng)過均質(zhì)處理的大豆蛋白，其電泳圖譜條帶與原始SPI進行對比，并沒有出現(xiàn)明顯的差別，說明酸性條件下均質(zhì)處理對大豆蛋白亞基結(jié)構(gòu)的影響并不大。但在分子量約為20100u的區(qū)域以及分子量大于97000u的區(qū)域都產(chǎn)生了少量新的條帶，并且隨著均質(zhì)壓力的升高，條帶顏色逐漸加深。說明在酸性條件下隨著均質(zhì)壓力的升高，部分高分子量肽鏈發(fā)生斷裂，形成分子量相對較小的肽鏈，而與此同時，亞基之間發(fā)生交聯(lián)聚集，形成新的亞基，由于在SDS－PAGE電泳中使用到破壞二硫鍵、疏水相互作用以及氫鍵等作用力的試劑，因此新的高分子亞基可能是由于共價相互作用而形成的。

圖1 SPI、各改性樣品及標準分子量樣品的SDS－PAGE圖譜Fig.1 SDS－PAGE of all the samples and marker

2.2 各改性樣品內(nèi)源熒光掃描分析

在290nm輻射波激發(fā)下，大豆蛋白熒光發(fā)射光譜主要來自于色氨酸殘基，又名內(nèi)源熒光光譜，其峰位在波長325～350nm之間。熒光強度和最大吸收波長λmax的改變反映了色氨酸殘基變化的程度和所處微環(huán)境的變化。Lakemond等人研究表明［10］，11S在發(fā)生亞基解離的時候，內(nèi)源熒光掃描的最大吸收波長λmax會向長波長的方向移動(紅移)。

SPI、酸處理樣品以及酸性條件下不同均質(zhì)壓力處理的樣品，其內(nèi)源熒光掃描最大吸收波長如圖2所示。從圖2可以看出，AT的λmax為335.2nm，大于常規(guī)工序(pH4.5酸沉后回調(diào)pH7.0復溶)所得SPI的333.0nm，這表明酸處理使大豆蛋白結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部活性基團暴露，在回調(diào)中性(pH7.0)之后，雖然大豆蛋白發(fā)生重聚集，但往往不能恢復到原來的結(jié)構(gòu)，依然有部分活性基團暴露在蛋白質(zhì)的表面，所以導致酸處理后的樣品其色氨酸暴露程度大于原始SPI，最大吸收波長呈現(xiàn)出紅移的趨勢。當均質(zhì)壓力為20MPa時，λmax進一步紅移，達到336.0nm，大豆蛋白展開程度進一步加大，導致回調(diào)中性后暴露的活性基團更多。而從40MPa開始，隨著均質(zhì)壓力的增大，最大吸收波長開始下降(藍移)，當均質(zhì)壓力達到80MPa時，λmax僅為333.6nm，表明隨著均質(zhì)壓力的增大，大豆蛋白的聚集程度加大，結(jié)構(gòu)越來越緊密，包裹于蛋白內(nèi)部的活性基團越來越多。

2.3 各改性樣品粒徑的變化

SPI、酸處理以及酸性條件下不同均質(zhì)壓力處理后，大豆蛋白的粒徑變化如圖3所示。從圖3可以看出，單純酸處理后回調(diào)中性所得樣品的粒徑為63.42nm，大于SPI的51.07nm。結(jié)合內(nèi)部熒光掃描數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，在酸處理的過程中，大豆蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生展開，結(jié)構(gòu)變得松散，內(nèi)部活性基團暴露，在回調(diào)中性的過程中，大豆蛋白雖然會發(fā)生重聚集，但難以恢復到天然的緊密球狀結(jié)構(gòu)，因此導致粒徑相對于天然SPI變大，這一結(jié)果與Utsumi等人所得結(jié)論一致［11］。

圖2 SPI及各改性樣品內(nèi)源掃描最大吸收波長的變化Fig.2 λmaxof fluorescence spectroscopy of all the samples

圖3 SPI及各改性樣品平均粒徑的變化Fig.3 The average hydrodynamic diameter of all the samples

而在酸性條件下，隨著均質(zhì)壓力的升高，大豆蛋白粒徑呈現(xiàn)先增大后減小的過程，這主要是由于蛋白的展開和聚集而導致的。在均質(zhì)壓力為20MPa時，大豆蛋白粒徑增大至86.55nm，同時其樣品內(nèi)源熒光最大吸收波長發(fā)生紅移，可以證實20MPa均質(zhì)導致了大豆蛋白結(jié)構(gòu)進一步展開，從而使其粒徑增大。當均質(zhì)壓力達到40MPa時，其粒徑繼續(xù)增大至94.33nm，但其內(nèi)源掃描最大吸收波長發(fā)生藍移，說明在40MPa均質(zhì)的過程中，前期發(fā)生展開的大豆蛋白開始發(fā)生聚集，形成粒徑較大的聚集體。而隨著均質(zhì)壓力的進一步升高，大豆蛋白粒徑下降。當均質(zhì)壓力達到80MPa時，其粒徑為79.80nm，同時內(nèi)源熒光掃描最大吸收波長繼續(xù)藍移，說明80MPa形成的聚集體結(jié)構(gòu)較其他改性樣品更緊密。

2.4 各改性樣品溶解性的分析

SPI、酸處理樣品以及酸性條件下不同壓力均質(zhì)處理的樣品，溶解性的變化如圖4所示。由圖4可知，酸處理的樣品溶解性略高于SPI，這可能是因為酸處理過程中大豆蛋白結(jié)構(gòu)展開，暴露出活性基團，增強了蛋白的水合作用［12］。而在酸性條件下，隨著均質(zhì)壓力的增加，蛋白的溶解度呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢?？赡艿脑蚴牵谒嵝詶l件下，均質(zhì)壓力較低時(20MPa)，可以有效促使蛋白結(jié)構(gòu)的進一步展開，暴露更多的活性基團，因此溶解性得到改善。而當均質(zhì)壓力進一步增大時，由于大豆蛋白分子開始發(fā)生聚集，活性基團包埋于分子內(nèi)部，水合能力下降，因此溶解性下降。

圖4 中性條件下SPI及各改性樣品溶解度的變化Fig.4 The solubility in pH 7.0 of all the samples

2.5 各改性樣品乳狀液粒度分析

乳狀液中粒度分布是影響乳狀液穩(wěn)定性的關鍵因素，也是評價樣品乳化性的重要指標，乳狀液粒子越大，乳析過程越快，乳析率越高［13］。SPI、酸處理樣品及酸性條件下不同均質(zhì)壓力處理的樣品，其乳狀液的粒度分布如圖5和表1所示?？梢钥闯觯崽幚砗蟮臉悠?，其乳狀液表面積加權(quán)平均值D［3，2］為1.508小于SPI的1.572，這是由于酸處理后的樣品表面暴露較多的活性基團，有效降低油滴的表面張力而導致的。而隨著均質(zhì)壓力的升高，樣品乳狀液的D［3，2］和D［4，3］均呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，對應乳化性則呈現(xiàn)先下降后提升的趨勢。在20MPa時，可能由于大豆蛋白展開程度過大，內(nèi)部基團暴露過多，造成分子之間靜電排斥力較大，不利于大豆蛋白分子間的相互作用，無法在油滴表面形成網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)阻止油滴的聚集，因此所得乳狀液D［3，2］為1.555，乳化性較差。而隨著均質(zhì)壓力的增大，在40～80MPa之間，乳狀液D［3，2］和D［4，3］都不斷下降，D［3，2］最小可達0.631。這是因為在較高的均質(zhì)壓力下大豆蛋白分子之間相互作用加強，形成聚集體，并且結(jié)構(gòu)不斷趨于緊密，分子間通過一系列共價或非共價作用力在油滴表現(xiàn)形成具有一定強度的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，大大降低油滴的表面張力，有效阻止油滴之間的聚集，體現(xiàn)出較好的乳化特性。

表1 SPI及各改性樣品乳狀液D［3，2］和D［4，3］的變化Table 1 D［3，2］and D［4，3］of all the samples’emulsion

3 結(jié)論

通過SDS－PAGE分析、內(nèi)部熒光掃描最大吸收波長的變化以及平均粒徑的分析可以看出，pH3.0酸處理可以有效使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生展開，暴露出更多的活性基團，其功能特性相對于SPI有所改善。而在酸性條件下經(jīng)過不同均質(zhì)壓力處理的樣品，呈現(xiàn)出先進一步解離而后發(fā)生聚集的變化趨勢，并且聚集程度和緊密度隨著均質(zhì)壓力的增大而增大。在功能特性方面，低壓均質(zhì)(20MPa)可以有效提高大豆蛋白的溶解性，而較高均質(zhì)壓力(40～80MPa)有利于乳化特性的改善，這與蛋白的聚集與解離程度有關。

圖5 SPI及各改性樣品乳狀液的粒度分布Fig.5 The particle size distribution of all the samples’emulsions

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Effects of high－pressure homogenization in acid condition on the structure and functional properties of soybean proteins

YUAN Bo－en，ZHAO Qiang－zhong，ZHAO Mou－ming*
(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

Through SDS－PAGE，hydrodynamic diameter and fluorescence spectroscopy，the effects of highpressure homogenization in acid conditions(pH3.0)on the structure of soybean proteins were investigated.The changes of protein functional properties were also investigated.The results showed that high－pressure homogenization in acid conditions led to slight impacts on the subunits of soybean proteins.With the homogenization pressure increasing，the hydrodynamic diameter would increase，and decrease later，which was the highest(94.33nm)at 40MPa.A similar change tendency was observed on the λmaxof fluorescence spectroscopy of soybean proteins，indicating the structures of soybean proteins unfolded and then aggregated.When the homogenization pressure was 20MPa，a most significant unfolding was obtained，and the λmaxwas 336.0nm.As to the functional properties，the solubility was improved remarkably when the pressure reached 20MPa.The particle size distribution of emulsion decreased with the homogenization pressure increasing.

soybean protein;acid treatment;high－pressure homogenization;structure;functional properties

TS201.2+1

A

1002－0306(2012)08－0117－04

由于大豆蛋白富含營養(yǎng)成分及具有優(yōu)良的功能性質(zhì)，因此被廣泛應用于乳制品、烘焙食品以及肉制品等各類型食品中。據(jù)報道，目前60%的食品均含有大豆蛋白［1］。為了滿足生產(chǎn)需要及各類型食品對特定功能特性的要求，在實際生產(chǎn)中一般需要對大豆蛋白進行改性處理以提高某方面的功能特性。但由于大豆蛋白中的球蛋白，尤其是11S蛋白，結(jié)構(gòu)緊密且功能特性較差，若使用單一改性手段進行改性處理，能耗高，效率低，且改性效果不佳［2］。因此，目前國內(nèi)外傾向于研究復合手段對蛋白質(zhì)的改性作用。研究報道表明，在酸性條件下大豆蛋白會發(fā)生亞基解離導致結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部活性基團暴露［3］。在此基礎上配合其他處理手段能在較溫和條件下使蛋白分子發(fā)生聚集，形成分子柔性較強的可溶性聚集體，有效改善功能特性。近年來，由于物理改性所得產(chǎn)品無毒無副作用而且可控性較強，多種物理改性方式已經(jīng)廣泛應用到實際生產(chǎn)中。由于高壓均質(zhì)對蛋白產(chǎn)生剪切效應、空穴作用以及熱效應等作用，其對蛋白改性具有較好的效果［4］。因此高壓均質(zhì)已成為國內(nèi)外對于蛋白改性方法的研究熱點。本文在pH3.0的條件下使用不同均質(zhì)壓力對大豆蛋白進行酸解離－高壓均質(zhì)處理，研究其對大豆蛋白功能特性的影響，以期為大豆蛋白改性技術(shù)的發(fā)展提供理論指導。

2011－06－24 *通訊聯(lián)系人

源博恩(1986－)，男，碩士研究生，研究方向:食品生物技術(shù)。

廣東省高等學校高層次人才項目(粵教師函(2010)79號);國家自然科學基金(20806030)。