江津津，黎海彬，韓 明，黃建初，王 英

(廣州城市職業(yè)學(xué)院建筑環(huán)境與食品工程學(xué)院，廣東廣州510405)

超聲熱浸-紫外分光光度法測(cè)定蜂巢蜜中總黃酮含量

江津津，黎海彬，韓 明，黃建初，王 英

(廣州城市職業(yè)學(xué)院建筑環(huán)境與食品工程學(xué)院，廣東廣州510405)

建立了一種快速提取測(cè)定蜂巢蜜中總黃酮含量的方法—超聲熱浸紫外分光光度法。蜂巢蜜、蜂膠、蜂皇漿、椴樹(shù)蜜的超聲熱浸提取液用聚酰胺柱層析去除雜質(zhì)干擾后，用分光光度法在360nm波長(zhǎng)處測(cè)定總黃酮含量。此方法回收率均在90%以上，變異系數(shù)均低于2%，具有良好的準(zhǔn)確度。與傳統(tǒng)方法相比，該方法具有試劑用量少，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，蜂巢蜜中總黃酮含量為14.97mg/100g，雖僅為蜂膠產(chǎn)品總黃酮含量的0.87%，但與其它蜂產(chǎn)品進(jìn)行比較，總黃酮含量至少高出蜂王漿、洋槐蜜、椴樹(shù)蜜一倍。蜂巢蜜作為一種新面市的保健食品，在黃酮類活性物質(zhì)含量上表現(xiàn)出更高的保健價(jià)值。

蜂巢蜜，總黃酮，超聲熱浸提

1.1 材料與設(shè)備

蜂巢蜜、洋槐蜜、椴樹(shù)蜜、蜂膠、蜂王漿 廣東養(yǎng)生源蜂業(yè)有限公司;甲醇，苯(分析純)，超純水，蘆丁(生化試劑，≥99%)。

YJ－3200 DTD型超聲清洗儀、ALC－210.4型電子分析天平、恒溫水浴鍋、層析柱 廣州精科化玻儀器有限公司定制;循環(huán)水真空泵 西安常儀儀器設(shè)備有限公司;超純水儀 美國(guó)Millipore公司;UV1100型紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)，JJ－2型高速組織搗碎機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 原料除雜后置冰箱，于0～6℃冷藏后取出，立即粉碎，備用。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 取5.0mg蘆丁，加甲醇溶解并定容至100mL，即得濃度為50μg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.3 蜂膠與蜂王漿中總黃酮的提取 分別稱取蜂膠與蜂王漿樣品0.5g和5g置于250mL燒杯中，用甲醇溶解后定容至100mL，充分混勻后倒回250mL燒杯中于40℃下超聲提取20min，靜置［8］，用移液管吸取上清液1.0mL于玻璃蒸發(fā)皿中，加入5.0mL乙醇及1g聚酰胺粉，用玻璃棒混勻吸附，于60℃水浴上揮去甲醇，先吸取10.0mL苯液將蒸發(fā)皿上的聚酰胺粉混勻，然后一并轉(zhuǎn)入關(guān)閉活塞的層析柱中，再分別吸取5.0mL苯液清洗玻璃蒸發(fā)皿，最后也將苯液和殘留聚酰胺粉一并轉(zhuǎn)入層析柱中，20mL苯液分3次完成。15min后開(kāi)啟層析柱活塞，棄去苯液并關(guān)閉層析柱活塞，取下平底燒瓶，將25mL容量瓶裝于層析柱下方。吸取20mL甲醇，分3次清洗玻璃蒸發(fā)皿，再將甲醇轉(zhuǎn)入層析柱中，15min后開(kāi)啟層析柱活塞將黃酮洗脫于25mL容量瓶中，用甲醇定容至25mL。

1.2.4 蜂巢蜜與其他蜂蜜中總黃酮的提取 稱量20g粉碎過(guò)篩后的蜂蜜，放入250mL燒杯中，加入不同濃度甲醇溶液，放于超聲波清洗器內(nèi)超聲提取，設(shè)定提取時(shí)間，進(jìn)行四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，以確定最佳超聲熱浸提參數(shù)。將提取液和醇不溶物抽濾分離，用移液管吸取上清液1.0mL于玻璃蒸發(fā)皿中，后續(xù)柱層析操作與1.2.3中相同。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為考察熱浸提溫度、提取時(shí)間、醇濃度、料液比等主要影響因素對(duì)樣品總黃酮提取的影響。按照表1設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)表Table 1 One－factor experimental design

1.2.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以黃酮測(cè)定含量為考核指標(biāo)，以影響測(cè)定含量的4個(gè)因素變量:提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、甲醇濃度(C)和料液比(D)，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表(表2)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，確定超聲波提取最佳工藝條件。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Orthogonal experimental design

1.2.7 樣品中總黃酮含量的測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作［5］:精確稱取蘆丁對(duì)照品5.0mg，加甲醇溶解，并定容至100mL，此對(duì)照溶液含蘆丁對(duì)照品50μg/mL。取6個(gè)10mL容量瓶，分別準(zhǔn)確吸取該蘆丁對(duì)照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL置于10mL容量瓶中，加入甲醇補(bǔ)足至10.0mL，搖勻，放置一刻鐘后，置于1cm比色皿中于波長(zhǎng)360nm處測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算回歸方程。

樣品測(cè)定:將用層析柱洗脫出來(lái)的已用甲醇定容至25mL的蜂巢蜜、蜂王漿、洋槐蜜、椴樹(shù)蜜及蜂膠總黃酮提取液置于1cm比色皿中于波長(zhǎng)360nm測(cè)定其吸光值，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

式中:X2:試樣中總黃酮的含量(mg/100g);A:由標(biāo)準(zhǔn)曲線算得被測(cè)液中黃酮量(μg);V2:試樣定容總體積(mL);V1:吸取的上清液體積(mL);M3:試樣質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 蜂巢蜜甲醇浸提單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在浸提過(guò)程中，溫度是影響最終提取物黃酮含量的重要因素。甲醇濃度固定為≥95%的條件下，分別在20～40℃溫度范圍內(nèi)隨著溫度的升高，蜂巢蜜中測(cè)定的黃酮含量也隨之增加。溫度≥40℃時(shí)對(duì)黃酮含量的影響不大，考慮蜂巢蜜中蜂蠟的溶解度和能耗方面的問(wèn)題，確定提取溫度在40℃左右進(jìn)行。

隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，測(cè)定含量變化緩慢無(wú)顯著增長(zhǎng)，所以總黃酮的提取時(shí)間選擇在8h內(nèi)較為合適。

不同料液比對(duì)蜂巢蜜進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著料液比的增大，測(cè)定的黃酮含量無(wú)明顯增大，結(jié)合GB/T 24283－2009中的提取方法，采用將1∶10范圍內(nèi)的醇提物直接定容到100mL容量瓶。

在提取時(shí)間不超過(guò)8h，提取溫度恒溫在40℃的條件下，料液比1∶10，考察不同醇濃度對(duì)測(cè)定的黃酮含量變化情況。結(jié)果表明隨著醇濃度的增加，測(cè)定的總黃酮含量也逐漸增大，所以確定提取用甲醇濃度設(shè)定在80%以上。

2.2 蜂巢蜜超聲熱浸提正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 L9(34)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of L9(34)tests

由表3的極差R值大小反映出各因素對(duì)蜂巢蜜總黃酮提取率大小影響順序?yàn)樘崛囟龋玖弦罕龋敬紳舛龋咎崛r(shí)間，即超聲波提取蜂膠過(guò)程中，提取溫度和料液比為主要影響因素，超聲波熱浸提蜂巢蜜的最佳工藝應(yīng)為A1B2C3D1，為進(jìn)一步確定蜂巢蜜中總黃酮的提取率，對(duì)最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最后得出最佳工藝參數(shù):提取溫度為40℃，甲醇濃度≥95%，料液比為1∶5，超聲波提取時(shí)間20min，這最佳工藝條件下黃酮提取率為15%，高于表3中出現(xiàn)的任一提取率，說(shuō)明經(jīng)過(guò)正交實(shí)驗(yàn)方案優(yōu)化得到的提取條件是科學(xué)的。超聲輔助溶劑熱浸提法操作簡(jiǎn)便，收率高，成本明顯較超臨界萃取法等其他方法低，操作時(shí)間短［7－12］。

2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)吸光度數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行直線回歸得方程:y=0.0277x－0.0031，R2= 0.9999。本實(shí)驗(yàn)選用的測(cè)定方法源自國(guó)標(biāo) GB/T 24283－2009，在國(guó)標(biāo)基礎(chǔ)上有所改良［13－15］，所得的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性良好。所以蜂巢蜜中總黃酮含量的測(cè)定以紫外分光光度法為優(yōu)。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of Rutin

2.4 精密度與回收率

隨機(jī)取同一品種的蜂產(chǎn)品勻漿混勻，做7次平行實(shí)驗(yàn)，對(duì)其進(jìn)行誤差分析，結(jié)果表明各類樣品的標(biāo)準(zhǔn)差均≤0.07，變異系數(shù)均低于2%，表明實(shí)驗(yàn)具有很好的重復(fù)性，精密度高。取已知總黃酮含量的樣品做回收率實(shí)驗(yàn)，分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.010g和0.020g，加標(biāo)后的測(cè)定值與本底值的差與加標(biāo)量相比，得到的回收率均≥90%，說(shuō)明測(cè)定方法可靠。

2.5 蜂巢蜜與其他蜂產(chǎn)品中總黃酮含量的比較

實(shí)驗(yàn)測(cè)得蜂巢蜜中總黃酮含量為14.97mg/100g，與蜂膠總黃酮含量1730.39mg/100g相比有很大差距，僅為蜂膠產(chǎn)品總黃酮含量的0.87%。與洋槐蜜、椴樹(shù)蜜、蜂王漿進(jìn)行比較(圖3)，則含量明顯高于洋槐蜜的4.64mg/100g、蜂王漿的7.67mg/100g和椴樹(shù)蜜的2.50mg/100g。

圖3 不同蜂產(chǎn)品中總黃酮含量比較Fig.3 Contents of total flavone of all samples

3 結(jié)論

3.1 本研究采用超聲波輔助甲醇熱浸提的方式提取蜂產(chǎn)品中的黃酮類化合物，提出了蜂巢蜜中總黃酮提取的新方法。

3.2 本研究根據(jù)總黃酮類物質(zhì)在紫外波長(zhǎng)360nm處有最大吸收的原理，與其他檢測(cè)方法相比，省去用硝酸鋁或三氯化鋁溶液作顯色劑顯色的步驟［15－17］，通過(guò)在紫外波長(zhǎng)360nm處直接測(cè)定吸收值并用工作曲線定量來(lái)完成測(cè)定。針對(duì)不同的蜂產(chǎn)品中所含黃酮類物質(zhì)的差異，提出了總黃酮測(cè)定的快捷方法，方法可靠且有創(chuàng)新。

3.3 蜂巢蜜作為一種新面市的保健食品，總黃酮含量比一般蜂蜜和蜂王漿至少多近1倍，在黃酮類活性物質(zhì)含量上表現(xiàn)出更高的保健價(jià)值。

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Ultrasonic sound hot extract－ultraviolet spectrophotometric determination of total flavone in comb honey

JIANG Jin－jin，LI Hai－bin，HAN Ming，HUANG Jian－chu，WANG Ying
(College of Building Environment and Food Engineering，Guangzhou City Polytechnic，Guangzhou 510405，China)

Ultrasonic sound hot extract coupled with ultraviolet spectrophotometric was used to determinatate the total flavone in comb honey.Comb honey，propolis，royal jelly and linden honey were treated with polyamind column chromatography first to remove the impurities，then treated with methanol extract and ultrasonic sound hot extract. The detection method of total flavone was spectrophotometric method performed at 360nm.The mean spike recovery rates of the established method for total flavone in all samples were above 90%with a coefficient of variation of less than 2%.This method displayed excellent precision，had many advantages over the conventional method，such as less reagent consumption and ease of operation.The content of total flavone in comb honey was 14.97mg/100g，It was only 0.87%of that of propolis，but compared with some bee products，the content was nearly doubled.As a new healthy food，comb honey had digher value on total flavone.

comb honey;total flavone;ultrasonic sound hot extract

TS201.2

A

1002－0306(2012)08－0092－03

蜂巢蜜俗稱“蜂窩蜜”，是由蜂巢和蜂蜜兩部分組成的一種成熟蜜，也稱“封蓋蜜”。它集蜂膠、蜂王漿、花粉、蜂蜜、蜂蠟等天然營(yíng)養(yǎng)成分為一體，被譽(yù)為蜜中之極品［1－2］。黃酮類化合物被證實(shí)具有抗炎癥、抗過(guò)敏、抗感染、抗腫瘤等功效［3－4］，國(guó)家衛(wèi)生部和食品藥品監(jiān)督管理局將總黃酮作為蜂膠保健食品的標(biāo)志性成分指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，同時(shí)列入產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)［5－6］。但關(guān)于蜂巢蜜中總黃酮的提取與含量測(cè)定的研究至今未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

2011－06－29

江津津(1977－)，女，博士，講師，主要從事食品科學(xué)方面的研究。

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2010B090400113);廣州市教育系統(tǒng)創(chuàng)新學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(200915)。