姜苗苗， 張 宇， 馮毅凡

（廣東藥學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006）

中藥指紋圖譜是目前能夠?yàn)閲?guó)內(nèi)外廣泛接受的一種中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式。1H-NMR作為一種波譜型指紋圖譜與傳統(tǒng)色譜型指紋圖譜相比，在將復(fù)方中藥體系中所有有效成分盡可能多的表現(xiàn)出來(lái)方面，具有全面性和整體性的優(yōu)勢(shì)［1-3］。由于1H-NMR中質(zhì)子信號(hào)峰與樣品中各個(gè)化合物的氫原子一一對(duì)應(yīng)，因此1H-NMR指紋圖譜是一種表達(dá)復(fù)方中藥體系的合適的整體表征模式。此外，1H-NMR指紋圖譜無(wú)須樣品預(yù)處理，可避免色譜分離造成的成分損失，同時(shí)不會(huì)破壞樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)［4］，適合于中藥口服液類樣品的快速檢識(shí)。銀翹解毒液作為常用清熱解毒類非處方中藥口服液，主要由金銀花、連翹、桔梗、淡竹葉、牛蒡子、薄荷、荊芥、淡豆豉和甘草九味中藥材組成［5］，目前尚無(wú)其指紋圖譜研究的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次建立了銀翹解毒液的1H-NMR指紋圖譜，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供一種全面、有效、快速可行的檢測(cè)方法。

1 儀器與試藥

BRUKER AVANCEⅢ500型超導(dǎo)核磁共振波譜儀，質(zhì)子激發(fā)頻率500.13 MHz，配置BBFO正相觀察寬帶探頭和BVT3200數(shù)字控溫儀。美國(guó)Wilmad WG-5000核磁樣品管。D2O氘代度＞99.8%，美國(guó)Norell公司。實(shí)驗(yàn)用10批銀翹解毒液(110101，110201，110203，110302，110305，110402，110502，110602，110605，110606)購(gòu)自廣東華南藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的配置

精密移取銀翹解毒液樣品450 μL，轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管中，并加入50 μL D2O，混合均勻后將核磁管加封直接用于1H-NMR測(cè)試。

2.2 1H-NMR測(cè)試條件

測(cè)定溫度298 K；觀測(cè)頻率500.13 MHz；譜寬10330.58 Hz；90°脈沖寬度 14.50 μs；采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)65536；掃描次數(shù)32次；延遲時(shí)間6 s；混合時(shí)間0.1 s；接受增益128。

2.3 1H-NMR指紋圖譜的測(cè)定

供試品溶液在500 MHz核磁共振儀上采用Topspin 2.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行操控測(cè)試，以90%H2O+10%D2O鎖場(chǎng)，使用預(yù)飽和脈沖序列NOESYGPPR1D在δ4.7處壓制水峰，在2.2項(xiàng)的測(cè)試條件下測(cè)定1H-NMR圖譜，得到一組FID信號(hào)。經(jīng)過傅里葉變換、窗函數(shù)擬合、相位與基線校正，并用蔗糖端基質(zhì)子信號(hào)定標(biāo)后，得到1H-NMR指紋圖譜。

2.4 圖譜與分析數(shù)據(jù)的處理

應(yīng)用MetresNova軟件在δ 0～9.0范圍進(jìn)行分段積分，以0.04為最小間隔積分，得到224個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，即每段化學(xué)位移值下的相對(duì)峰面積積分值，并建立Excel數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù)相似度計(jì)算原理，利用Excel 2003軟件進(jìn)行相似度分析。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一份銀翹解毒液供試品溶液，在上述1H-NMR測(cè)試條件下連續(xù)6次測(cè)定指紋圖譜，用2.3項(xiàng)下的方法處理圖譜，得到一系列相對(duì)峰面積積分值。計(jì)算6組數(shù)據(jù)之間的相關(guān)系數(shù)和夾角余弦值，結(jié)果均在0.99以上，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次銀翹解毒液供試品溶液6份，測(cè)試1H-NMR指紋圖譜，計(jì)算6組數(shù)據(jù)相對(duì)峰面積積分值之間的相關(guān)系數(shù)和夾角余弦值，結(jié)果均在0.99以上，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份銀翹解毒液供試品溶液，分別在 0、4、8、12、16、20 h 測(cè)試1H-NMR 指紋圖譜，計(jì)算6組數(shù)據(jù)相對(duì)峰面積積分值之間的相關(guān)系數(shù)和夾角余弦值，結(jié)果均在0.99以上，表明供試品溶液在常溫實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定性良好。

2.6 指紋圖譜相似度分析

按2.1項(xiàng)下方法將10批銀翹解毒液樣品制備成供試品溶液，采用2.2、2.3和2.4項(xiàng)下方法測(cè)定和處理指紋圖譜。10批樣品的1H-NMR指紋圖譜見圖1。

圖1 10批銀翹解毒液1H-NMR指紋圖譜Fig.1 1H-NMR fingerprint for ten batches of Yinqiao Jiedu Liquid

分別選擇平均矢量和中位數(shù)矢量作為對(duì)照指紋圖譜，計(jì)算10批樣品的相關(guān)系數(shù)和夾角余弦值，結(jié)果10批銀翹解毒液樣品中有8批樣品的相關(guān)系數(shù)和夾角余弦相似度在0.97以上，另外2批樣品差異性較大，相似度在0.82～0.91之間。見表1。

表1 10批銀翹解毒液相似度分析計(jì)算結(jié)果Tab.1 Evaluation of similarities on ten batches of Yinqiao Jiedu Liquid

3 討論

3.1 水峰壓制技術(shù)

在常規(guī)1H-NMR譜測(cè)試中口服液中的水峰質(zhì)子信號(hào)非常強(qiáng)，常常掩蓋了樣品組分信號(hào)峰，因此有效的水峰抑制是測(cè)定口服液指紋圖譜中的重要問題。我們分別采用預(yù)飽和單脈沖(1D sequence with f1 presaturation，ZGPR)、反相梯度預(yù)飽和單脈沖(1D sequence with presaturation using composite pulse and spoil gradient，ZGCPGPPR)、通過 T1作用增強(qiáng)的水峰抑制(WET solvent suppression with shape pulse，WET)和弛豫延遲和混合時(shí)間的預(yù)飽和梯度脈沖(with presaturation during relaxation delay and mixing time and spoil gradient，NOESYGPPR1D)4 種水峰抑制方法采集銀翹解毒液的1H-NMR指紋圖譜。所得的1H-NMR指紋圖譜表明(圖2)，4種方法對(duì)水峰抑制效率各不相同。其中NOESYGPPR1D抑制水峰效率最高，譜基線平整，改善了低濃度組分的信噪比和分辨率，因此本實(shí)驗(yàn)選擇NOESYGPPR1D為1HNMR指紋圖譜制譜過程中關(guān)鍵脈沖序列。

圖2 4種脈沖序列下的銀翹解毒液1H-NMR指紋圖譜Fig.2 1H-NMR fingerprints of Yinqiao Jiedu Liquid acquired by four different pulse programs

3.2 指紋圖譜特征分析與評(píng)價(jià)

銀翹解毒液樣品的1H-NMR信號(hào)峰分布在δ 0～9.0之間，主要分為三個(gè)特征區(qū)域:δ 0～3.0的飽和脂肪區(qū)、δ 3.0～5.5的糖基質(zhì)子區(qū)以及δ 5.5～9.0的芳香區(qū)(圖3)。低場(chǎng)區(qū)δ 5.5～9.0的芳香質(zhì)子信號(hào)主要來(lái)自金銀花中綠原酸等咖啡酰類有機(jī)酸和黃酮類成分［6］，連翹中苯乙醇苷和木脂素類成分［7］，淡竹葉中的黃酮［8］，牛蒡子中的木脂素［9］以及其他藥材中大量帶苯環(huán)的化合物。δ 3.0～5.5的質(zhì)子信號(hào)主要來(lái)自口服液中的蔗糖和糖苷類化合物。高場(chǎng)區(qū)δ 0～3.0的飽和質(zhì)子信號(hào)主要來(lái)源于連翹和桔梗中的三萜類成分［7，10］以及薄荷中薄荷醇等單萜類揮發(fā)油［11］等成分。根據(jù)上述分析，考察了藥材陰性對(duì)照液與銀翹解毒液的相關(guān)性(圖4)，發(fā)現(xiàn)在銀翹解毒液的1H-NMR指紋圖譜中，芳香區(qū)和飽和脂肪區(qū)范圍的質(zhì)子信號(hào)表征了其的主要成分特征及相對(duì)比例，而中藥制劑的化學(xué)成分及其比例差異性則反應(yīng)了其質(zhì)量的變化。

圖3 銀翹解毒液樣品1H-NMR圖譜的指紋分析Fig.3 Fingerprinting analyses for typical1H-NMR spectrum of Yinqiao Jiedu Liquid

圖4 藥材陰性對(duì)照液與銀翹解毒液相關(guān)性考察Fig.4 Relationship between negative control solutions of herbs and Yinqiao Jiedu Liquid

本實(shí)驗(yàn)對(duì)10批銀翹解毒液指紋圖譜進(jìn)行研究，其相關(guān)系數(shù)和夾角余弦值的相似度計(jì)算結(jié)果顯示:不同批次樣品指紋圖譜主要峰群的整體面貌基本一致，但是在化學(xué)位移和相對(duì)積分面積值方面存在一定的差異，2批樣品與其他8批樣品的相似度相差較大，提示其質(zhì)量的一致性和穩(wěn)定性有所差異。另外，我們考察了市售銀翹解毒液和同類產(chǎn)品銀翹解毒合劑［12］的1H-NMR指紋圖譜(圖5)，盡管二者的藥材成分相同，但其芳香區(qū)和飽和脂肪區(qū)質(zhì)子信號(hào)具有明顯差異，進(jìn)一步說明該方法對(duì)樣品測(cè)定的專屬性有合理的鑒定。

本實(shí)驗(yàn)所建立的1H-NMR指紋圖譜法穩(wěn)定性高，精密度好，重現(xiàn)性佳，且分析速度快，同時(shí)全面表征了中藥復(fù)方制劑中的多種復(fù)雜化學(xué)成分，化學(xué)位移對(duì)應(yīng)的相對(duì)峰面積積分值也可以反應(yīng)出化學(xué)成分之間的相對(duì)比例，因此本研究可以為市售銀翹解毒液的質(zhì)量評(píng)價(jià)以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

圖5 銀翹解毒液與銀翹解毒合劑1H-NMR圖譜Fig.5 1H-NMR spectra of Yinqiao Jiedu Liquid and Yinqiao Jiedu Mixture

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