張曉萍， 丁永輝， 楊 錫， 朱 宇

（1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省食品藥品檢驗(yàn)所 甘肅 蘭州 730000）

前列泰丸是由益母草、萹蓄、紅花、油菜蜂花粉、知母 (鹽炒)、黃柏(鹽炒)六味藥材，經(jīng)水提濃縮等工藝制備的濃縮丸，是由國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)［標(biāo)準(zhǔn)編號(hào):WS3-090(Z-015)-2002(Z)］前列泰片改劑型而來的，具有清熱利濕、活血散結(jié)的功效［1］，臨床上對(duì)濕熱蘊(yùn)結(jié)、瘀血阻絡(luò)所致的慢性前列腺炎癥有較好的療效。為完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效控制該制劑的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)方中萹蓄、紅花、知母、黃柏四味藥材采用TLC法定性分析，益母草為方中君藥，經(jīng)查閱文獻(xiàn)［2-5］，建立了用HPLC-ELSD法測(cè)定其中鹽酸水蘇堿的方法，方法簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀系列:在線脫氣機(jī)，四元泵，Lcsolution工作站，柱溫箱，ELSD-Ⅱ蒸發(fā)光散射器；KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；德國(guó)Sartorius R200D型分析天平(十萬分之一)；上海梅特勒AE240型分析天平(萬分之一)；CAMAG薄層色譜掃描儀。

1.2 試藥 對(duì)照品及對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，鹽酸水蘇堿對(duì)照品(批號(hào)110712-200508)；鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)110713-200609)、菝葜皂苷元對(duì)照品(批號(hào)110744-200509)、山柰素對(duì)照品(批號(hào)110861-200606)、紅花對(duì)照藥材(批號(hào)120907-200609)；前列泰丸(甘肅河西制藥有限責(zé)任公司提供，批號(hào)為090801、090802、090803)；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 薄層鑒別［6］

圖1 黃柏藥材中鹽酸小檗堿的薄層鑒別

2.1.1 黃柏 取本品(3批)1 g，研細(xì)，加乙醇30 mL，超聲30 min，濾過，濾液水浴蒸干，加甲醇5 mL溶解。另取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨水(6∶6∶3∶3∶1)為展開劑，置氨蒸氣預(yù)飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視［7］。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的黃色熒光斑點(diǎn)。按處方比例及制備工藝，配制缺少黃柏藥材的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液，陰性對(duì)照無干擾。結(jié)果見圖1。

2.2.2 萹蓄 取本品(3批)2 g，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液水浴蒸干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，水液以三氯甲烷提取兩次，每次15 mL，三氯甲烷液棄去，水液加濃鹽酸1 mL，三氯甲烷25 mL，水浴回流提取1 h，分取三氯甲烷層，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取山柰素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶3∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，于紫外燈光下(365nm)檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的黃色熒光斑點(diǎn)。按處方比例及制備工藝，配制缺少萹蓄藥材的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液，陰性對(duì)照無干擾。結(jié)果見圖2。

圖2 萹蓄藥材中山柰素的薄層鑒別

2.2.3 紅花 取本品(3批)3 g，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液水浴蒸干，殘?jiān)铀?5 mL溶解，以乙醚提取2次，每次20 mL，棄去乙醚液，水液加水飽和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取紅花對(duì)照藥材2 g，加水100 mL煎煮1 h，用脫脂棉趁熱過濾，濾液濃縮至約15 mL，加乙醇使含醇量達(dá)50%，混合均勻，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5mL使溶解，以水飽和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙醚(3∶2)為展開劑，預(yù)飽和15 min，展開，取出，晾干，置飽和氨蒸氣中熏15 min，于紫外燈光下(365 nm)檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)。按處方比例及制備工藝，配制缺少紅花藥材的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液，陰性對(duì)照品無干擾。結(jié)果見圖3。

圖3 紅花藥材的薄層鑒別

2.2.4 知母 取本品(3批)5 g，研細(xì)，加乙醇50 mL，水浴回流40 min，放冷，濾過，濾液濃縮至10 mL，加水25 mL，混勻，用三氯甲烷洗滌兩次，每次20 mL，棄去三氯甲烷液，水液加濃鹽酸5 mL，水浴回流1 h，放冷，用三氯甲烷振搖提取兩次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，加氨試液30 mL洗滌，棄去氨洗液，三氯甲烷液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取菝契皂苷元對(duì)照品［8］，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以含5%香草醛的10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的黃色斑點(diǎn)。按處方比例及制備工藝，配制缺少知母藥材的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液，陰性對(duì)照無干擾。結(jié)果見圖4。

2.2 定量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Venusil HILIC柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈-0.2%冰醋酸(79 ∶21)，體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；ELSD檢測(cè)器:空氣壓縮機(jī)350 kPa，霧化室溫度47℃，增益值為2，進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取在105℃干燥至恒質(zhì)量的鹽酸水蘇堿對(duì)照品11.17 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1 mL含鹽酸水蘇堿1.1170 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

圖4 知母藥材中菝葜皂苷元薄層鑒別

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品，研細(xì)，取約5 g，精密稱定，精密加入50 mL乙醇［9］，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(功率 250 W，頻率 100 Hz)［10］，放冷，再稱定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，水浴蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，定量轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取3次，每次25 mL，棄去乙酸乙酯液，水液水浴蒸干，殘?jiān)右掖?0 mL使溶解，加于中性氧化鋁-改性活性炭柱上(內(nèi)徑 1.5 cm，中性氧化鋁，色譜純 100～200目，3 g∶1 g，先乙醇濕法裝柱，然后用5%的三乙胺乙醇溶液15 mL預(yù)洗)，用乙醇洗脫，收集洗脫液120 mL，水浴蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶，定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例及制備工藝，配制不含益母草藥材的陰性樣品，同法制備陰性樣品溶液。

2.2.5 方法的專屬性考察 在上述色譜條件下，鹽酸水蘇堿峰與其他成分達(dá)到基線分離，且峰形良好；陰性樣品試驗(yàn)結(jié)果表明提取物中其它成分對(duì)水蘇堿的測(cè)定無干擾，理論塔板數(shù)按鹽酸水蘇堿計(jì)不小于6000。結(jié)果見圖5。

圖5 前列泰丸高效液相色譜圖

2.2.6 線性關(guān)系的考察 取2.2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μL 分別進(jìn)樣，按上述色譜條件記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，以峰面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，鹽酸水蘇堿對(duì)照品進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=1.1466X+4.5823，r=0.9999；鹽酸水蘇堿進(jìn)樣量在5.5850～27.9250 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果鹽酸水蘇堿的RSD為0.22%。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一個(gè)批號(hào)的前列泰丸(批號(hào):090801)，平行取樣6份，按2.2.3項(xiàng)法操作并檢測(cè)。鹽酸水蘇堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.37 mg/g，RSD為0.10%，表明方法重復(fù)性較好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的供試品溶液(批號(hào):090801)，于 0、4、8、12、16 、20、24 h按上述色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，按峰面積計(jì)算，鹽酸水蘇堿的RSD值為0.19%，表明供試品溶液中鹽酸水蘇堿在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知量的樣品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.28 mg/g)9份，分成3組(每組3份)，置50 mL量瓶中，每組分別精密加入2.5204 mg/mL的鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液4、5、6 mL，加乙醇約40 mL，超聲處理30 min(功率250 W，頻率100 Hz)，放冷，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，按2.2.3項(xiàng)下，自精密量取續(xù)濾液25 mL起，同法操作，測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 鹽酸水蘇堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.2.11 樣品測(cè)定 取3批樣品，同2.2.3項(xiàng)方法處理樣品，作為供試品溶液。用0.45 μm微孔濾膜過濾，各取續(xù)濾液20 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算樣品中鹽酸水蘇堿的量，結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 黃柏的TLC鑒別 黃柏中小檗堿的薄層鑒別，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［11］，曾采用正丁醇-乙酸-水(4∶1∶1∶1)為展開劑展開，發(fā)現(xiàn)展開時(shí)間太長(zhǎng)，且重復(fù)性不好，依據(jù)小檗堿生物堿的特性及經(jīng)濟(jì)的考慮，選用本文所提供的展開劑，結(jié)果表明，展開時(shí)間適宜，重復(fù)性好，斑點(diǎn)清晰。

3.2 萹蓄的TLC鑒別 萹蓄中主要含有山柰素、槲皮素、楊梅樹皮素等黃酮類化學(xué)成分［12-13］，本實(shí)驗(yàn)用雙相酸水解的方法提取其中的黃酮類成分作為供試品，用山柰素作對(duì)照，點(diǎn)于同一薄層板上，結(jié)果顯示:供試品中主斑點(diǎn)與山柰素在相同位置顯相同顏色，斑點(diǎn)清晰。

3.3 測(cè)定供試品純化方法的考察 研究發(fā)現(xiàn)，活性炭對(duì)鹽酸水蘇堿有吸附［14］，用5%三乙胺乙醇溶液使活性炭改性，采用中性氧化鋁柱、中性氧化鋁-活性炭柱、中性氧化鋁-改性活性炭柱分別上樣，比較純化及定量測(cè)定結(jié)果，實(shí)驗(yàn)表明:中性氧化鋁-改性活性炭柱能夠凈化供試品溶液，并使待測(cè)成分完全洗脫。

3.4 檢測(cè)方法和色譜柱的選擇 曾采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法［15］，用磺酸基團(tuán)鍵合硅膠(SCX)陽離子交換柱，用紫外檢器(檢測(cè)波長(zhǎng)192 nm)測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)干擾很大，分離度差。改用通用型檢測(cè)器蒸發(fā)光檢測(cè)器(ELSD)進(jìn)行檢測(cè)，選擇穩(wěn)定性好的親水性丙基酰胺鍵合硅膠柱(HILIC)為色譜柱進(jìn)行分離，結(jié)果表明:樣品中鹽酸水蘇堿與各雜質(zhì)組分得到基線分離，且色譜峰良好，可用于前列泰丸中鹽酸水蘇堿的定量測(cè)定。

［1］王聰慶，陳 娟，師彥平，等.高效液相色譜法測(cè)定前列泰片中山柰素的含量［J］.分析測(cè)試與儀器，2008，14(1):50-53.

［2］李 林.水蘇堿的研究概況［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(3):930-931.

［3］賀東兵.HPLC法測(cè)定前列泰膠囊的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2005，9(1):46-47.

［4］況 艷，李志浩，鄭 芳.HPLC-ELSD法測(cè)定產(chǎn)后逐瘀片中鹽酸水蘇堿的含量［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，16(12):89-91.

［5］馮 旭，杜成智，梁臣艷，等.HPLC-ELSD測(cè)定益母草中鹽酸水蘇堿的含量［J］.廣西中醫(yī)藥，2007，30(6):53-54.

［6］常新全，丁麗霞.中藥活性成分分析手冊(cè)［M］.北京:學(xué)苑出版社，2002:699，1619，2042.

［7］李玉琴，陳 磊，逯海龍.傷痛寧膏中冰片、黃柏的薄層鑒別方法的研究［J］.寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2010，32(11):1063-1064.

［8］廖洪利，王偉新，趙福勝，等.知母化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2005，23(1):12-14.

［9］王文彤，馬雪梅，朱永智.不同溶劑提取對(duì)益母草中生物堿含量的影響［J］.天津藥學(xué)，2003，15(3):5，19.

［10］郭孝武，楊 銳.不同頻率超聲提取對(duì)益母草總堿提出率的影響［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，1999，19(8):465-466.

［11］黃有霖，潘 馨.成方中黃連、黃柏的薄層鑒別的研究［J］.海峽藥學(xué)，2003，15(2):36-37.

［12］趙愛華，趙勤實(shí)，林中文，等.萹蓄的化學(xué)成分研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2002，14(5):29-31.

［13］吳呈祥，陳 君，張 蕾，等.中藥萹蓄的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.藥學(xué)與臨床研究，2009，17(5):365-369.

［14］王勝偉，朱利敏.HPLC法測(cè)定鮮益母草中鹽酸水蘇堿的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2006，21(1):15-16.

［15］萬 軍，周 霞，齊紅藝，等.前列泰膠囊中鹽酸水蘇堿含量的 HPLC 研究［J］.天津中醫(yī)藥，2005，22(5):425-427.