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        痛寧膠囊對硝酸甘油型偏頭痛大鼠下丘腦、腦干NOS和5-HT表達(dá)的影響

        2012-11-01 14:07:46楊德功付秋菊黃厚才鐘榮玲朱婉華田耀洲
        中成藥 2012年2期
        關(guān)鍵詞:動物模型模型

        楊德功, 付秋菊, 黃厚才, 鐘榮玲, 朱婉華, 田耀洲

        (1.江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,江蘇 南京 210028;2.南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇 南京 210046;3.南通良春風(fēng)濕病醫(yī)院,江蘇 南通 226009)

        痛寧膠囊是南通良春風(fēng)濕病醫(yī)院用于治療偏頭痛的院內(nèi)制劑,其組方為孟河醫(yī)派傳人、國醫(yī)大師朱良春教授經(jīng)驗(yàn)名方,早在50年代即臨床應(yīng)用,療效顯著,隨后于1963年發(fā)表于《中醫(yī)雜志》,但其治療偏頭痛的機(jī)制仍不清楚,為此我們通過復(fù)制硝酸甘油型偏頭痛動物模型,觀察了痛寧膠囊對偏頭痛大鼠下丘腦、腦干NOS及5-HT表達(dá)的影響,探討痛寧膠囊治療偏頭痛的作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用痛寧膠囊提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 動物與分組 SD大鼠48只,上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司,許可證號:SCXK(滬)2008-0016,雌雄各半,體質(zhì)量(283±23)g,隨機(jī)分為空白對照組、模型組、陽性藥物組、痛寧膠囊高、中、低劑量組,每組8只。

        1.1.2 主要藥物與試劑 痛寧膠囊,南通良春風(fēng)濕病醫(yī)院院內(nèi)制劑,批準(zhǔn)文號:蘇藥制字 Z04 001376;產(chǎn)品批號: 091208;硝酸甘油注射液,每1 mL含硝酸甘油5 mg,由北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H11020289,生產(chǎn)批號:20 100911;琥珀酸舒馬普坦片,由天津華津制藥有限公司生產(chǎn),批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字 H20040700,生產(chǎn)批號:006909T,用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的藥液備用;兔抗 5-羥色胺抗體(Anti-5-HT),貨號 bs-1126R;兔抗一氧化氮合成酶-1 抗體(神經(jīng)型)(Anti-NOS-1),貨號 bs-0156R,均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;SABC免疫組化檢測試劑盒,購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司;DAB購自美國Sigma公司;PBS緩沖液:南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室配制,每升中 含 8 g NaCl,0.2 g KCl,1.44 g Na2HPO4,0.24 g KH2PO4,pH調(diào)至7.4;其它試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

        1.2 方法

        1.2.1 偏頭痛模型建立及藥物干預(yù) 根據(jù)Tassorelli C等[1]報(bào)道的方法,除空白對照組不作處理,其余各組動物予以大鼠皮下注射硝酸甘油10 mL/kg,制作偏頭痛模型;30 min后按組灌胃給藥。空白對照組和模型對照組灌胃等容積的蒸餾水,陽性藥物對照組灌胃琥珀酸舒馬普坦藥液6 mL/kg,痛寧膠囊藥液高、中、低劑量組分別以 8.64、4.32、2.16 g/kg藥液灌胃。

        1.2.2 灌注、取材、切片 造模后4 h,立即用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉動物,仰臥固定,開胸,主動脈插管,剪開右心耳。首先迅速灌注無菌生理鹽水200 mL,然后灌注4℃4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液150 mL,灌注后取大鼠腦組織,在4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中再固定24 h,常規(guī)脫水,石蠟包埋。制備下丘腦、腦干石蠟切片。

        1.2.3 免疫組化SABC法 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;PBS洗2遍,每遍5 min;切片浸入3%H2O2水溶液中,室溫封閉10 min,以去除內(nèi)源性過氧化物酶;PBS洗3遍,每遍5 min;抗原微波修復(fù)20 min;PBS洗2遍,每遍5 min;滴加正常山羊血清封閉液,室溫20 min。甩去多余液體;滴加一抗,4℃過夜;PBS洗2遍,每遍5 min;滴加生物素化二抗,37℃孵育30 min;PBS洗2遍,每遍5 min;滴加試劑SABC,37℃孵育20 min;PBS洗3遍,每遍5 min;滴加0.05%DAB+0.01%H2O2,顯色5~15 min;顯微鏡下隨時觀察顯色反應(yīng),至陽性顯色較強(qiáng)而背景不顯色時,自來水洗,終止顯色反應(yīng);蘇木素襯染、透明,中性樹膠封片。

        1.2.4 圖片分析 光鏡下細(xì)胞核呈棕黃色染色者為陽性細(xì)胞。用顯微鏡照相系統(tǒng)和數(shù)碼成像系統(tǒng)進(jìn)行拍攝200倍圖片,用Image ProPlus5.0.2圖像分析軟件測定各組每張切片上陽性細(xì)胞的平均面積。

        2 結(jié)果

        大鼠下丘腦、腦干經(jīng)免疫組化SABC法染色后,光鏡下背景為淡黃色,NOS、5-HT陽性細(xì)胞均呈棕黃色或棕褐色,多散在分布(見圖1~16中紅色箭頭所示)。經(jīng)數(shù)碼成像系統(tǒng)和圖像分析軟件,得如下結(jié)果。

        2.1 各組大鼠下丘腦、腦干NOS陽性細(xì)胞平均面積的比較 下丘腦:與空白對照組比較,模型對照組NOS陽性細(xì)胞平均面積顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組比較,陽性藥物對照組、痛寧膠囊高劑量組、中劑量組NOS陽性細(xì)胞平均面積均有不同程度減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),而低劑量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高、中劑量組分別與陽性藥物對照組比較,統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異(P>0.05)。腦干:與空白對照組比較,模型對照組NOS陽性細(xì)胞平均面積明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組比較,陽性藥物對照組、高劑量組NOS陽性細(xì)胞平均面積均有不同程度減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而中、低劑量組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高劑量組與陽性藥物對照組均能明顯減少NOS陽性細(xì)胞平均面積,二者比較統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異(P>0.05)。見表1,圖1~8。

        表1 痛寧膠囊對硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠腦組織中NOS表達(dá)陽性細(xì)胞平均面積的影響()

        表1 痛寧膠囊對硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠腦組織中NOS表達(dá)陽性細(xì)胞平均面積的影響()

        注:與空白對照組比較,*P<0.05;**P<0.01;與模型對照組比較,△P<0.05;△△P<0.01;與陽性藥物對照組比較,▲P>0.05。下同。

        組別 動物/只劑量/(g·kg - 1)NOS平均面積/μm 2下丘腦 腦干空白對照 8 —221.35±67.68 243.10±53.81模型對照 8 — 317.52±60.34** 354.29±80.96**琥珀酸舒馬普坦 8 0.006 236.67±34.05△△ 275.05±52.06△痛寧膠囊 8 8.64 232.06±34.44△△▲ 257.52±72.73△▲痛寧膠囊 8 4.32 249.39±43.06△▲ 264.997±88.60痛寧膠囊8 2.16 288.13±66.25 297.64±91.96

        圖1 偏頭痛動物模型空白組下丘腦NOS陽性細(xì)胞 (×200)

        圖2 偏頭痛動物模型模型組下丘腦NOS陽性細(xì)胞 (×200)

        圖3 偏頭痛動物模型陽性藥物組下丘腦NOS陽性細(xì)胞 (×200)

        圖4 偏頭痛動物模型痛寧膠囊高劑量組下丘腦NOS陽性細(xì)胞(×200)

        圖5 偏頭痛動物模型空白組腦干NOS陽性細(xì)胞 (×200)

        圖6 偏頭痛動物模型模型組腦干NOS陽性細(xì)胞 (×200)

        圖7 偏頭痛動物模型陽性藥物組腦干NOS陽性細(xì)胞(×200)

        圖8 偏頭痛動物模型痛寧膠囊高劑量組腦干NOS陽性細(xì)胞(×200)

        2.2 各組大鼠下丘腦、腦干5-HT陽性細(xì)胞平均面積的比較下丘腦:與空白對照組比較,模型對照組5-HT陽性細(xì)胞平均面積顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組比較,陽性藥物對照組、高、中劑量組5-HT陽性細(xì)胞平均面積均有不同程度增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),而低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高劑量組、中劑量組分別與陽性藥物對照組比較,統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異(P>0.05)。腦干:與空白對照組比較,模型對照組5-HT陽性細(xì)胞平均面積顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對照組比較,陽性藥物對照組、高劑量組5-HT陽性細(xì)胞平均面積均有不同程度增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而中、低劑量組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高劑量組與陽性藥物對照組均能顯著增加5-HT陽性細(xì)胞平均面積,二者比較統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異(P>0.05)。見表2,圖9~16。

        表2 痛寧膠囊對硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠腦組織中5-HT表達(dá)陽性細(xì)胞平均面積的影響 ()

        表2 痛寧膠囊對硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠腦組織中5-HT表達(dá)陽性細(xì)胞平均面積的影響 ()

        組別 動物/只劑量/(g·kg - 1)5-HT 平均面積/μm 2下丘腦 腦干空白對照 8 —442.62±90.87 378.31±99.00模型對照 8 — 221.24±50.42** 262.32±59.61*琥珀酸舒馬普坦 8 0.006 343.55±56.54△△ 322.31±30.31△痛寧膠囊 8 8.64 381.24±36.15△△▲ 324.16±49.26△▲痛寧膠囊 8 4.32 312.03±85.65△▲ 299.83±54.91痛寧膠囊8 2.16 252.17±53.35 243.88±45.65

        圖10 偏頭痛動物模型模型組下丘腦5-HT陽性細(xì)胞(×200)

        圖11 偏頭痛動物模型陽性藥物組下丘腦5-HT陽性細(xì)胞 (×200)

        圖12 偏頭痛動物模型痛寧膠囊高劑量組下丘腦5-HT陽性細(xì)胞 (×200)

        圖13 偏頭痛動物模型空白組腦干5-HT陽性細(xì)胞 (×200)

        圖14 偏頭痛動物模型模型組腦干5-HT陽性細(xì)胞 (×200)

        圖15 偏頭痛動物模型陽性藥物組腦干5-HT陽性細(xì)胞 (×200)

        圖16 偏頭痛動物模型痛寧膠囊高劑量組腦干5-HT陽性細(xì)胞(×200)

        3 討論

        許多實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明,NO在偏頭痛和其他血管性頭痛的產(chǎn)生機(jī)制中起著十分關(guān)鍵的作用[2]。其可通過擴(kuò)張血管,引發(fā)神經(jīng)源性炎癥,激活傷害感覺神經(jīng)元的敏感性,介導(dǎo)機(jī)體內(nèi)痛覺信號的傳導(dǎo),從而放大其生物學(xué)作用,致使痛覺的發(fā)生[3]。而NOS是合成NO的關(guān)鍵酶,可催化左旋精氨酸(L-Arg)生成瓜氨酸的同時釋放出內(nèi)源性NO,前者NOS活性的增高與痛敏狀態(tài)的維持有密切關(guān)系[4],且NOS陽性神經(jīng)元可能通過單突觸或多突觸連接引起自主神經(jīng)核運(yùn)動核激活,參與偏頭痛的伴發(fā)癥狀如惡心、嘔吐等[5]。而后者可能協(xié)同其它神經(jīng)遞質(zhì)在疼痛刺激的中樞傳遞中起重要作用,不但可以激發(fā)偏頭痛,而且能夠維持偏頭痛狀態(tài)[6]。

        實(shí)驗(yàn)中,予以皮下注射硝酸甘油后,大鼠下丘腦、腦干部位NOS表達(dá)增強(qiáng),說明硝酸甘油能夠誘發(fā)NOS表達(dá),NO合成增加,而進(jìn)一步參與組織的發(fā)生免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng),而予以痛寧膠囊干預(yù)后能夠顯著降低其表達(dá),表明痛寧膠囊能夠阻止由硝酸甘油誘發(fā)的NOS的反應(yīng),減少內(nèi)源性NO的生成。

        研究發(fā)現(xiàn),下丘腦中含有多種 5-HT 的受體的亞型[7-8],而不同類型5-HT受體在痛覺生理和病理生理中有不同的作用,在偏頭痛的發(fā)病機(jī)制中更是復(fù)雜。5-HT2A受體激動能夠引起NO的生成增加,從而引起顱腦血管的擴(kuò)張,致敏血管周圍疼痛感受器和三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)中樞傷害性感受神經(jīng)元,觸發(fā)頭痛[9]。5-HT1B/1D受體激動劑,如舒馬普坦、佐米曲坦等能夠選擇性作用于血管平滑肌,使擴(kuò)張的顱內(nèi)動脈(主要是硬腦膜動脈)收縮,通過減少血管活性肽如降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)在血管周圍間隙的釋放,能減輕神經(jīng)源性炎癥,且對腦干及上部頸髓的三叉神經(jīng)尾側(cè)核的傷害性痛覺傳遞有抑制作用,還能調(diào)整一氧化氮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及鈉離子依賴性細(xì)胞代謝活動[10]。形態(tài)學(xué)研究證明5-HT1FmRNA在三叉神經(jīng)節(jié)有較高分布,選擇性的 5-HT1F受體激動劑lasmiditan可抑制電刺激三叉神經(jīng)節(jié)誘導(dǎo)的硬腦膜血漿蛋白的外滲及三叉神經(jīng)尾側(cè)c-fos的表達(dá)[11],并且能夠有效治療偏頭痛的急性發(fā)作[12],提示對于偏頭痛急性發(fā)作,5-HT1F受體的激動是一種可能的新的治療原則[13]。

        本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛大鼠腦干、下丘腦5-HT表達(dá)水平下降,而予以痛寧膠囊進(jìn)行干預(yù)后,5-HT的表達(dá)水平上調(diào),這可能是痛寧膠囊激動下丘腦部位5-HT受體亞型,使得傷害性痛覺上行傳導(dǎo)抑制;并且刺激腦干的5-HT能神經(jīng)元,激活5-HT疼痛下行調(diào)控系統(tǒng)。

        綜上所述,痛寧膠囊能夠通過降低NOS的表達(dá)、上調(diào)5-HT的水平,從而調(diào)整與疼痛相關(guān)的血管活性物質(zhì)及神經(jīng)遞質(zhì)的水平,改善血管舒縮功能障礙,這可能是其治療偏頭痛的作用機(jī)制之一。

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