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        高糖條件下forskolin誘導胰島系INS-1細胞血紅素氧合酶1的表達

        2012-11-01 03:57:18楊怡邵瑋娟于志文
        關(guān)鍵詞:高糖胰島孵育

        楊怡 邵瑋娟 于志文

        胰島素抵抗過程中的胰島細胞損害是糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵機制。氧化應(yīng)激損傷是誘發(fā)胰島素抵抗的主要因素之一。因此,對胰腺β細胞的氧化應(yīng)激損傷的機制研究以及抗氧化治療成為糖尿病治療研究的內(nèi)容之一。

        目前細胞中調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Nrf2(nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2,Nrf2)受到格外關(guān)注。Nrf2即紅細胞系相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2,調(diào)控的主要是多種抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶基因,包括血紅素加單氧酶(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(catalase)等。上述酶均參與維持氧化還原狀態(tài)的穩(wěn)定。

        研究提示典型的Nrf2下游調(diào)控酶,如HO-1的表達可改善細胞或組織的胰島素敏感性[1]。目前臨床上剛剛開始應(yīng)用的GLP-1藥物,通過激活PKA信號通路的途徑,已經(jīng)觀察到可以減輕胰島細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)[2],PKA通路激活還可上調(diào)Nrf2功能[3],但PKA激活劑 forskolin在胰島細胞能否調(diào)控HO-1表達以對抗胰島細胞的氧化應(yīng)激損傷至今尚未見報道。因此本文擬觀察forskolin對大鼠胰島β細胞株INS-1細胞內(nèi)HO-1的表達影響。實驗的初步結(jié)果將對胰島素抵抗的抗氧化治療提供新的藥物作用機制解釋。

        1 材料和方法

        1.1 材料 INS-1細胞為大鼠胰島素瘤細胞系;RPMI-1640培養(yǎng)基;forskolin及葡萄糖;HO-1兔單抗、SOD2兔多抗、catalase兔多抗、羊抗兔二抗。

        1.2 方法

        1.2.1 INS-1細胞培養(yǎng) INS-1細胞以RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),并置于體積分數(shù)5%CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中,每周傳代1次。

        1.2.2 胰島β細胞氧化應(yīng)激細胞模型的制備 INS-1細胞傳代培養(yǎng)2代后,將細胞按照5×106密度進行傳代分組,即正常對照、高糖和forskolin3個組,分別持續(xù)培養(yǎng)4、19 h。實驗共重復(fù)3次。

        1.2.3 Western blot檢測HO-1蛋白的表達 取蛋白40 μg上樣,行10%SDS-PAGE電泳后,在轉(zhuǎn)移槽中將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,TBS緩沖液洗膜、封閉、4℃過夜。依次加入一抗(HO-1單抗1∶1000、SOD2多抗1∶500、catalase多抗1∶1000)二抗(羊抗兔 1∶4000、羊抗鼠1∶4000),ECL發(fā)光法曝光顯影,結(jié)果經(jīng) Image-Pro plus6.0軟件進行灰度分析。

        2 結(jié)果

        2.1 短時程作用 4 h 25 MM高糖培養(yǎng)細胞與10 MM葡萄糖培養(yǎng)細胞對照組相比,降低了HO-1和catalase的蛋白表達;而forskolin在5 MM、10 MM葡萄糖培養(yǎng)的細胞,均增加了上述兩種抗氧化酶的表達,并預(yù)防了高糖誘導的HO-1和catalase蛋白表達下降 (P<0.05),如圖1所示,forskolin孵育后HO-1和catalase的表達較未加forskolin組明顯上調(diào)。

        2.2 長時程作用 為了進一步明確高糖和forskolin對胰島細胞抗氧化酶影響,將高糖和forskolin的孵育時間延長到19 h,結(jié)果如圖2所示,19 h高糖孵育明顯降低SOD2的蛋白表達,而forskolin孵育后HO-1和SOD2、catalase的表達較單獨高糖處理組都有了明顯上調(diào)(P<0.05)。

        圖1 不同濃度葡萄作用4 h與Forskolin的協(xié)同作用對INS-1細胞內(nèi)抗氧化酶調(diào)節(jié)作用

        圖2 不同濃度葡萄糖作用19 h協(xié)同F(xiàn)orskolin對INS-1細胞內(nèi)抗氧化酶調(diào)節(jié)作用

        3 討論

        Forskolin是一種腺苷酸環(huán)化酶(AC)激動劑,激活A(yù)C催化亞基,使得細胞內(nèi)cAMP水平升高。cAMP作為第二信使激活PKA,從而使多種底物蛋白發(fā)生磷酸化調(diào)節(jié)細胞內(nèi)活動。PKA可進一步調(diào)控CBP[CREB(Camp-response-elementbinding protein)-binding protein]從而影響Nrf2基因轉(zhuǎn)錄功能[3]。多項實驗均證實PKA可增強HO-1表達,這間接提示forskolin具有激活Nrf2作用。實驗結(jié)果初步表明在持續(xù)高糖培養(yǎng)條件下,forskolin刺激的PKA信號通路可以消除高糖對Nrf2-ARE的抑制作用。但25 mM葡萄糖似乎對抗氧化酶的表達有一定的刺激作用。本文首次證實forskolin對多種抗氧化酶具有上調(diào)作用,且能保護高糖產(chǎn)生的抗氧化酶抑制作用。這項研究也對臨床上被應(yīng)用的GLP-1類藥物保護胰島細胞作用機制提供了新線索。

        [1] Hoehn KL,Salmon AB,Hohnen-Behrens C,et al.Insulin resistance is a cellular antioxidant defense mechanism.Proc Natl Acad Sci,2009,106:17787-17792.

        [2] Wideman RD,Yu IL,Webber TD,et al.Improving function and survival of pancreatic islets by endogenous production of ghcagonlike peptide 1(GLP-1).PNAS,2006,103(36):13468-13473.

        [3] Jianyong ZHANG,Tomonori HOSOYA,Atsushi MARUYAMA,et al.Nrf2 Neh5 domain is differentially utilized in the transactivation of cytoprotective genes.Biochem.J,2007,404,459-466.

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