金正明 何軍 鮑曉晶 吳小津 孫愛寧 袁曉妮 李楊 徐超 吳德沛

自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞是異基因造血干細(xì)胞移植后最早迅速重建的一群免疫細(xì)胞，NK細(xì)胞表面殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptors，KIR)的異源反應(yīng)活性在造血干細(xì)胞移植中的作用至關(guān)重要。在KIR /人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)受配體錯配模式的造血干細(xì)胞移植中，通過激活性KIR和抑制性KIR的相互作用使供者的NK細(xì)胞發(fā)生異源反應(yīng)活性，攻擊宿主白血病細(xì)胞，介導(dǎo)移植物抗白血病(graft versus leukemia，GVL)效應(yīng)，降低移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)的發(fā)生[1-2]。本課題前期研究了無關(guān)供體異基因造血干細(xì)胞移植中抑制性KIR的意義[3-4]，而本文著重探討激活性KIR受體在無關(guān)供體異基因造血干細(xì)胞移植中的作用。

材料與方法

一、材料

2006年1月至2007年12月來自中國造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫(Chinese Marrow Donor Program，CMDP)HLA高分辨定點實驗室提供的 HLA-A、B、Cw、DRB1和 DQB1高 分 辨 全相合的供受者共74對，按照白血病分型，其中急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)32例、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)22例、慢性粒細(xì)胞白血病 (chronic myelogenous leukemia，CML)20例。74對供受者中有38對進(jìn)行了移植并有移植后的隨訪結(jié)果，白血病分型ALL 18例、AML 12例、CML 8例。男27例，女11例，年齡4～45歲，平均27.2歲，其中4～19歲16例。移植術(shù)后患者隨訪到2008年12月。

二、實驗方法

1. KIR基因分型方法：采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP)基因分型。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，68℃退火30 s，72℃延伸 90 s，30 個循環(huán)。

2. KIR單體型分型：(1)A單體型：以抑制性KIR為主，僅有唯一的激活性KIR為KIR2DS4，KIR2DS4可進(jìn)一步分為2DS4*001/002和2DS4*003-007兩 組 亞 型；(2)B單體型：包含多種 激活性 KIR(KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR3DS1)的不同組合。

3. 激活性KIR的實驗分組：由CMDP提供的74對供受者按照供者激活性KIR基因的數(shù)目，分為激活性KIR數(shù)目< 3個和≥3個2組。

4. 儀器：3130XL基因測序儀，Perkin Elmer GeneAmp 9700 PCR擴(kuò)增儀，Ultra-Volet Products紫外凝膠成像儀。

5. 移植預(yù)處理方案和預(yù)防GVHD方案：改良BU/CY為移植預(yù)處理方案；CSA+MTX (d1，d3，d6，d11)+MMF+ATG為預(yù)防GVHD方案。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 15.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各類基因檢測結(jié)果用相對數(shù)表示，并用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存率分析，以P< 0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、激活性KIR基因在個體中的陽性比例

在CMDP74對供受者中，48對供受者有 KIR2DS1基 因 (64.87﹪)；33對供受者有KIR2DS2基因(44.60﹪)；26對供受者有KIR2DS3基因 (35.14﹪)；74對供受者有 KIR2DS4基因 (100.00﹪)；34對供受者有KIR2DS5基 因(45.95﹪)；45對供受者有KIR3DS1基因(60.81﹪)(圖1)。

圖1 不同激活性KIR基因在供受者中的陽性比例

二、供受者中的KIR基因單體分型在白血病分型中的分布

1.在供受者KIR基因單體型A中，9對為ALL、6對為AML、5對為CML。

2.在供受者KIR基因單體型B中，GVH方向(供者為KIR單體型B)：11對為ALL、15對為AML、9對為CML；HVG方向(受者為KIR單體型 B)：12對為 ALL、1對為 AML、6對為CML。在不同白血病分型中，B組激活性KIR的多態(tài)性較多，在AML分型中供者有KIR2DS1、KIR2DS3和KIR3DS1基因的比例明顯升高；在CML分型中供者有KIR2DS1和KIR3DS1基因的比例明顯升高；在ALL分型中供者有KIR2DS1、KIR2DS3和KIR3DS1基因的比例明顯降低(表1)。

表1 激活性KIR基因在不同白血病分型中的供受者分布情況(例)

三、在不同白血病分型中供受者激活性KIR的組合

GVH方向的KIR錯配模式中供者中有各種激活性KIR組合的比例高于受者，且以2～3種組合的激活性KIR為主(表2)。

四、KIR單體型A中激活性KIR2DS4亞型與移植術(shù)后的生存分析

1.在CMDP提供的74對供受者中100.0﹪的個體表達(dá)KIR2DS4，其中51.4﹪僅表達(dá)2DS4*001/002亞 型，23.6﹪ 僅 表達(dá) 2DS4*003-007亞 型，25.0﹪ 同 時 具 有 2DS4*001-002與2DS4*003-007亞型(圖2)。

圖2 KIR 單體型A中KIR2DS4的不同基因亞型

2.在CMDP提供的74對供受者中38例接受了全相合無關(guān)供者造血干細(xì)胞移植，其中有9例供受者均為KIR單體型A，3例為供受者KIR2DS4相同，僅具有2DS4*001/002基因亞型均在移植術(shù)后死亡，6例患者的2DS4與供者不完全一樣且供者均有2DS4*003-007基因亞型表達(dá)，除1例移植術(shù)后早期死亡以外，其余5例為1年后無病生存，生存率為83.3﹪(表3)。

表2 在不同白血病分型中的供受者激活性KIR基因的組合情況

表3 在KIR單體型A中供受者2DS4基因亞型的比較

五、在CMDP提供的74對供受者KIR單體型B中激活性KIR分析

在KIR單體型B中供者具有不同數(shù)量的激活性KIR受體(1～6個)，其中接受移植的38例患者1年生存率與不同的白血病分型相關(guān)：CML和AML患者中，當(dāng)供者有≥3個激活性KIR時1年生存率為42.86﹪(6/14)，當(dāng)供者激活性KIR< 3個時1年生存率為83.33﹪(5/6)；而在ALL患者中則呈相反趨勢，當(dāng)供者有≥3個激活性KIR時為87.50﹪(7/8)，當(dāng)供者aKIR < 3個時為50.0﹪(5/10)(圖3，4)。

圖3 當(dāng)供者激活性KIR < 3(n = 6)和激活性KIR≥3(n = 14)時，AML/CML患 者Kaplan-Meier生存曲線

圖4 當(dāng)供者激活性KIR < 3(n = 10)和激活性KIR≥3(n = 8)時，ALL患者Kaplan-Meier生存曲線

討 論

NK細(xì)胞固有的免疫系統(tǒng)是通過NK細(xì)胞表面受體KIR和組織相容性分子及激活性和抑制性KIR的平衡來調(diào)節(jié)的[5]。當(dāng)供者抑制性KIR受體缺失受者HLA-I類配體，阻抑信號解除，激活性KIR，隨著表達(dá)此抑制性KIR的NK細(xì)胞比例上升，更多傳遞活化信號激活供者來源NK細(xì)胞的抑制性KIR發(fā)揮異源反應(yīng)活性[6]。本實驗結(jié)果表明，AML和CML移植的供者中激活性KIR2DS1和KIR3DS1基因的表達(dá)最高；激活性KIR2DS3基因在AML移植中供者的表達(dá)遠(yuǎn)高于受者；而在ALL移植中供者的表達(dá)遠(yuǎn)低于受者。在前期研究中已表明：72.73﹪供者表達(dá)KIR2DL1，57.14﹪供者表達(dá) KIR3DL2，25.97﹪供者表達(dá)KIR3DL1[4]。因此，本研究提示：通過激活性KIR2DS1和KIR3DS1的過度激活抑制性KIR2DL1和KIR3DL1的表達(dá)，引發(fā)NK細(xì)胞的異源反應(yīng)活性，攻擊殘留的白血病細(xì)胞而發(fā)揮GVL效應(yīng)。

近年來國外對激活性KIR的研究一直是很片面的，供體激活性KIR的類型及表達(dá)高低無論是對無關(guān)供體還是單倍體的造血干細(xì)胞移植影響一直存在爭議[7]。Clausen等[6]學(xué)者在無關(guān)供者造血干細(xì)胞移植的研究中表明，若供者攜帶KIR2DS2基因，GvHD發(fā)生率及復(fù)發(fā)率較高、總生存率和無病生存率較低，不攜帶此基因總生存率和無病生存率均為92﹪。Kroger等[8]報道：在無關(guān)供體的造血干細(xì)胞移植中，供體激活性KIR的基因低表達(dá)或激活性KIR基因類型少，可預(yù)防復(fù)發(fā)，改善無病生存率。本研究初步揭示：在ALL類型的移植中，供者攜帶激活性KIR的基因類型多，引起GVHD發(fā)生率高，但1年生存率也高(為87.50﹪)；而在CML和AML類型的移植中，供者攜帶激活性KIR的基因類型少，GVHD發(fā)生程度較輕，1年生存率為83.33﹪。因此，供者攜帶激活性KIR基因數(shù)目及表達(dá)因疾病類型不同而對造血干細(xì)胞移植效果的影響也存在差異。供者激活性KIR數(shù)量少是ALL影響預(yù)后的不利因素，而對AML/CML生存率高。由于樣本量小作生存分析雖然差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但有此趨勢應(yīng)積累更多病例深入研究。

在KIR單體型A中僅有惟一的活化性受體KIR2DS4，單體型B有多種活化型受體的不同組合[9]。本實驗發(fā)現(xiàn)：在無關(guān)供者全相合移植中供受者均為單體型A時，雙方同時為2DS4*001/002純合移植預(yù)后較差，而供者具有2DS4*003-007時預(yù)后良好，推測2DS4*003-007是主要引起NK細(xì)胞異源活性的KIR2DS4基因亞型，有此區(qū)別的原因還不明了。Hou等[10]研究表明，在無關(guān)供體的造血干細(xì)胞移植中激活的KIR2DS4基因序列的差異，決定移植后GVHD的發(fā)生，因此，有待進(jìn)行深入研究。

綜上所述，本研究認(rèn)為，供受者的KIR單體型、激活性KIR基因亞型和數(shù)目在無關(guān)供體異基因造血干細(xì)胞移植中起關(guān)鍵的作用，對激活性KIR如何恰當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)抑制性KIR的表達(dá)引發(fā)NK細(xì)胞的異源反應(yīng)，從而能降低GVHD發(fā)生而增強(qiáng)GVL效應(yīng)，將是本課題今后的研究方向。

1 Ruggeri L, Capanni M, Mancusi A, et al. The impact of donor natural killer cell alloreactivity on allogeneic hematopoietic transplantation[J]. Transpl Immunol, 2005,14(3): 203-206.

2 Ruggeri L, Mancusi A, Capanni M, et al. Donor natural killer cell allorecognition of missing self in haploidentical hematopoietic transplantation for acute myeloid leukemia:challenging its predictive value[J]. Blood, 2007, 110(1):433-440.

3 何軍, 陳子興, 侯建全, 等. HLA-Cw基因的高分辨分型在造血干細(xì)胞移植中的意義的初步探討[J].中華微生物和免疫學(xué)雜志, 2007, 27(7):643-646.

4 鮑曉晶, 何軍, 陳子興, 等. 非親緣性HLA全相合的造血干細(xì)胞移植中供者-受者NK細(xì)胞KIR受體的研究[J].中華血液學(xué)雜志, 2007, 28(8):510-513.

5 Mei H, Margarita Fa, Yuhong G, et al. Natural killer cell crossmatch: Functional analysis of inhibitory killer immunoglobulin-like receptors and their HLA ligands[J].Human Immunology, 2007, 68(6):507-513.

6 Clausen J, Wolf D, Petzer AL, et al. Impact of natural killer cell dose and donor killer-cell Immunoglobulinlike receptor(KIR) genotype on outcome following human leucocyte antigen-identical haematopoietic stem cell transplantation[J]. Clinical and Experimental Immunology, 2007, 148(3):520-528.

7 Chiossone L, Vitale C, Cottalasso F, et al. Molecular analysis of the ethylprednisolone-mediated inhibition of NK-cell function: evidence for different susceptibility of IL-2– versus IL-15–activated NK cells[J]. Blood, 2007,109(9): 3767-3775.

8 Kroger N, Binder T, Zabelina T, et al. Low number of donor activating killer immunoglobulin-like receptors(KIR) genes but not KIR-ligand mismatch prevents relapse and improves disease-free survival in leukemia patients after in vivo T-cell depleted unrelated stem cell transplantation[J]. Transplantation, 2006, 82(8):1024-1030.

9 黎琉光, 王春燕. 自然殺傷細(xì)胞激活性和抑制性受體及其配體的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)內(nèi)科學(xué)分冊,2006, 33(1):10-13.

10 Hou LH, Steiner NK, Chen M, et al. KIR2DL1 allelic diversity:four new alleles characterized in a bone marrow transplant population and three families[J].Tissue Antigens, 2007, 69(3):250-254.