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        激活性KIR受體在HLA全相合無關(guān)供體異基因造血干細(xì)胞移植中的作用

        2012-10-30 06:46:58金正明何軍鮑曉晶吳小津孫愛寧袁曉妮李楊徐超吳德沛
        關(guān)鍵詞:抑制性供者受者

        金正明 何軍 鮑曉晶 吳小津 孫愛寧 袁曉妮 李楊 徐超 吳德沛

        自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞是異基因造血干細(xì)胞移植后最早迅速重建的一群免疫細(xì)胞,NK細(xì)胞表面殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptors,KIR)的異源反應(yīng)活性在造血干細(xì)胞移植中的作用至關(guān)重要。在KIR /人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)受配體錯配模式的造血干細(xì)胞移植中,通過激活性KIR和抑制性KIR的相互作用使供者的NK細(xì)胞發(fā)生異源反應(yīng)活性,攻擊宿主白血病細(xì)胞,介導(dǎo)移植物抗白血病(graft versus leukemia,GVL)效應(yīng),降低移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)的發(fā)生[1-2]。本課題前期研究了無關(guān)供體異基因造血干細(xì)胞移植中抑制性KIR的意義[3-4],而本文著重探討激活性KIR受體在無關(guān)供體異基因造血干細(xì)胞移植中的作用。

        材料與方法

        一、材料

        2006年1月至2007年12月來自中國造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫(Chinese Marrow Donor Program,CMDP)HLA高分辨定點實驗室提供的 HLA-A、B、Cw、DRB1和 DQB1高 分 辨 全相合的供受者共74對,按照白血病分型,其中急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)32例、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)22例、慢性粒細(xì)胞白血病 (chronic myelogenous leukemia,CML)20例。74對供受者中有38對進(jìn)行了移植并有移植后的隨訪結(jié)果,白血病分型ALL 18例、AML 12例、CML 8例。男27例,女11例,年齡4~45歲,平均27.2歲,其中4~19歲16例。移植術(shù)后患者隨訪到2008年12月。

        二、實驗方法

        1. KIR基因分型方法:采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP)基因分型。擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s,68℃退火30 s,72℃延伸 90 s,30 個循環(huán)。

        2. KIR單體型分型:(1)A單體型:以抑制性KIR為主,僅有唯一的激活性KIR為KIR2DS4,KIR2DS4可進(jìn)一步分為2DS4*001/002和2DS4*003-007兩 組 亞 型;(2)B單體型:包含多種 激活性 KIR(KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR3DS1)的不同組合。

        3. 激活性KIR的實驗分組:由CMDP提供的74對供受者按照供者激活性KIR基因的數(shù)目,分為激活性KIR數(shù)目< 3個和≥3個2組。

        4. 儀器:3130XL基因測序儀,Perkin Elmer GeneAmp 9700 PCR擴(kuò)增儀,Ultra-Volet Products紫外凝膠成像儀。

        5. 移植預(yù)處理方案和預(yù)防GVHD方案:改良BU/CY為移植預(yù)處理方案;CSA+MTX (d1,d3,d6,d11)+MMF+ATG為預(yù)防GVHD方案。

        三、統(tǒng)計學(xué)分析

        應(yīng)用SPSS 15.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,各類基因檢測結(jié)果用相對數(shù)表示,并用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存率分析,以P< 0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié) 果

        一、激活性KIR基因在個體中的陽性比例

        在CMDP74對供受者中,48對供受者有 KIR2DS1基 因 (64.87﹪);33對供受者有KIR2DS2基因(44.60﹪);26對供受者有KIR2DS3基因 (35.14﹪);74對供受者有 KIR2DS4基因 (100.00﹪);34對供受者有KIR2DS5基 因(45.95﹪);45對供受者有KIR3DS1基因(60.81﹪)(圖1)。

        圖1 不同激活性KIR基因在供受者中的陽性比例

        二、供受者中的KIR基因單體分型在白血病分型中的分布

        1.在供受者KIR基因單體型A中,9對為ALL、6對為AML、5對為CML。

        2.在供受者KIR基因單體型B中,GVH方向(供者為KIR單體型B):11對為ALL、15對為AML、9對為CML;HVG方向(受者為KIR單體型 B):12對為 ALL、1對為 AML、6對為CML。在不同白血病分型中,B組激活性KIR的多態(tài)性較多,在AML分型中供者有KIR2DS1、KIR2DS3和KIR3DS1基因的比例明顯升高;在CML分型中供者有KIR2DS1和KIR3DS1基因的比例明顯升高;在ALL分型中供者有KIR2DS1、KIR2DS3和KIR3DS1基因的比例明顯降低(表1)。

        表1 激活性KIR基因在不同白血病分型中的供受者分布情況(例)

        三、在不同白血病分型中供受者激活性KIR的組合

        GVH方向的KIR錯配模式中供者中有各種激活性KIR組合的比例高于受者,且以2~3種組合的激活性KIR為主(表2)。

        四、KIR單體型A中激活性KIR2DS4亞型與移植術(shù)后的生存分析

        1.在CMDP提供的74對供受者中100.0﹪的個體表達(dá)KIR2DS4,其中51.4﹪僅表達(dá)2DS4*001/002亞 型,23.6﹪ 僅 表達(dá) 2DS4*003-007亞 型,25.0﹪ 同 時 具 有 2DS4*001-002與2DS4*003-007亞型(圖2)。

        圖2 KIR 單體型A中KIR2DS4的不同基因亞型

        2.在CMDP提供的74對供受者中38例接受了全相合無關(guān)供者造血干細(xì)胞移植,其中有9例供受者均為KIR單體型A,3例為供受者KIR2DS4相同,僅具有2DS4*001/002基因亞型均在移植術(shù)后死亡,6例患者的2DS4與供者不完全一樣且供者均有2DS4*003-007基因亞型表達(dá),除1例移植術(shù)后早期死亡以外,其余5例為1年后無病生存,生存率為83.3﹪(表3)。

        表2 在不同白血病分型中的供受者激活性KIR基因的組合情況

        表3 在KIR單體型A中供受者2DS4基因亞型的比較

        五、在CMDP提供的74對供受者KIR單體型B中激活性KIR分析

        在KIR單體型B中供者具有不同數(shù)量的激活性KIR受體(1~6個),其中接受移植的38例患者1年生存率與不同的白血病分型相關(guān):CML和AML患者中,當(dāng)供者有≥3個激活性KIR時1年生存率為42.86﹪(6/14),當(dāng)供者激活性KIR< 3個時1年生存率為83.33﹪(5/6);而在ALL患者中則呈相反趨勢,當(dāng)供者有≥3個激活性KIR時為87.50﹪(7/8),當(dāng)供者aKIR < 3個時為50.0﹪(5/10)(圖3,4)。

        圖3 當(dāng)供者激活性KIR < 3(n = 6)和激活性KIR≥3(n = 14)時,AML/CML患 者Kaplan-Meier生存曲線

        圖4 當(dāng)供者激活性KIR < 3(n = 10)和激活性KIR≥3(n = 8)時,ALL患者Kaplan-Meier生存曲線

        討 論

        NK細(xì)胞固有的免疫系統(tǒng)是通過NK細(xì)胞表面受體KIR和組織相容性分子及激活性和抑制性KIR的平衡來調(diào)節(jié)的[5]。當(dāng)供者抑制性KIR受體缺失受者HLA-I類配體,阻抑信號解除,激活性KIR,隨著表達(dá)此抑制性KIR的NK細(xì)胞比例上升,更多傳遞活化信號激活供者來源NK細(xì)胞的抑制性KIR發(fā)揮異源反應(yīng)活性[6]。本實驗結(jié)果表明,AML和CML移植的供者中激活性KIR2DS1和KIR3DS1基因的表達(dá)最高;激活性KIR2DS3基因在AML移植中供者的表達(dá)遠(yuǎn)高于受者;而在ALL移植中供者的表達(dá)遠(yuǎn)低于受者。在前期研究中已表明:72.73﹪供者表達(dá)KIR2DL1,57.14﹪供者表達(dá) KIR3DL2,25.97﹪供者表達(dá)KIR3DL1[4]。因此,本研究提示:通過激活性KIR2DS1和KIR3DS1的過度激活抑制性KIR2DL1和KIR3DL1的表達(dá),引發(fā)NK細(xì)胞的異源反應(yīng)活性,攻擊殘留的白血病細(xì)胞而發(fā)揮GVL效應(yīng)。

        近年來國外對激活性KIR的研究一直是很片面的,供體激活性KIR的類型及表達(dá)高低無論是對無關(guān)供體還是單倍體的造血干細(xì)胞移植影響一直存在爭議[7]。Clausen等[6]學(xué)者在無關(guān)供者造血干細(xì)胞移植的研究中表明,若供者攜帶KIR2DS2基因,GvHD發(fā)生率及復(fù)發(fā)率較高、總生存率和無病生存率較低,不攜帶此基因總生存率和無病生存率均為92﹪。Kroger等[8]報道:在無關(guān)供體的造血干細(xì)胞移植中,供體激活性KIR的基因低表達(dá)或激活性KIR基因類型少,可預(yù)防復(fù)發(fā),改善無病生存率。本研究初步揭示:在ALL類型的移植中,供者攜帶激活性KIR的基因類型多,引起GVHD發(fā)生率高,但1年生存率也高(為87.50﹪);而在CML和AML類型的移植中,供者攜帶激活性KIR的基因類型少,GVHD發(fā)生程度較輕,1年生存率為83.33﹪。因此,供者攜帶激活性KIR基因數(shù)目及表達(dá)因疾病類型不同而對造血干細(xì)胞移植效果的影響也存在差異。供者激活性KIR數(shù)量少是ALL影響預(yù)后的不利因素,而對AML/CML生存率高。由于樣本量小作生存分析雖然差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義,但有此趨勢應(yīng)積累更多病例深入研究。

        在KIR單體型A中僅有惟一的活化性受體KIR2DS4,單體型B有多種活化型受體的不同組合[9]。本實驗發(fā)現(xiàn):在無關(guān)供者全相合移植中供受者均為單體型A時,雙方同時為2DS4*001/002純合移植預(yù)后較差,而供者具有2DS4*003-007時預(yù)后良好,推測2DS4*003-007是主要引起NK細(xì)胞異源活性的KIR2DS4基因亞型,有此區(qū)別的原因還不明了。Hou等[10]研究表明,在無關(guān)供體的造血干細(xì)胞移植中激活的KIR2DS4基因序列的差異,決定移植后GVHD的發(fā)生,因此,有待進(jìn)行深入研究。

        綜上所述,本研究認(rèn)為,供受者的KIR單體型、激活性KIR基因亞型和數(shù)目在無關(guān)供體異基因造血干細(xì)胞移植中起關(guān)鍵的作用,對激活性KIR如何恰當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)抑制性KIR的表達(dá)引發(fā)NK細(xì)胞的異源反應(yīng),從而能降低GVHD發(fā)生而增強(qiáng)GVL效應(yīng),將是本課題今后的研究方向。

        1 Ruggeri L, Capanni M, Mancusi A, et al. The impact of donor natural killer cell alloreactivity on allogeneic hematopoietic transplantation[J]. Transpl Immunol, 2005,14(3): 203-206.

        2 Ruggeri L, Mancusi A, Capanni M, et al. Donor natural killer cell allorecognition of missing self in haploidentical hematopoietic transplantation for acute myeloid leukemia:challenging its predictive value[J]. Blood, 2007, 110(1):433-440.

        3 何軍, 陳子興, 侯建全, 等. HLA-Cw基因的高分辨分型在造血干細(xì)胞移植中的意義的初步探討[J].中華微生物和免疫學(xué)雜志, 2007, 27(7):643-646.

        4 鮑曉晶, 何軍, 陳子興, 等. 非親緣性HLA全相合的造血干細(xì)胞移植中供者-受者NK細(xì)胞KIR受體的研究[J].中華血液學(xué)雜志, 2007, 28(8):510-513.

        5 Mei H, Margarita Fa, Yuhong G, et al. Natural killer cell crossmatch: Functional analysis of inhibitory killer immunoglobulin-like receptors and their HLA ligands[J].Human Immunology, 2007, 68(6):507-513.

        6 Clausen J, Wolf D, Petzer AL, et al. Impact of natural killer cell dose and donor killer-cell Immunoglobulinlike receptor(KIR) genotype on outcome following human leucocyte antigen-identical haematopoietic stem cell transplantation[J]. Clinical and Experimental Immunology, 2007, 148(3):520-528.

        7 Chiossone L, Vitale C, Cottalasso F, et al. Molecular analysis of the ethylprednisolone-mediated inhibition of NK-cell function: evidence for different susceptibility of IL-2– versus IL-15–activated NK cells[J]. Blood, 2007,109(9): 3767-3775.

        8 Kroger N, Binder T, Zabelina T, et al. Low number of donor activating killer immunoglobulin-like receptors(KIR) genes but not KIR-ligand mismatch prevents relapse and improves disease-free survival in leukemia patients after in vivo T-cell depleted unrelated stem cell transplantation[J]. Transplantation, 2006, 82(8):1024-1030.

        9 黎琉光, 王春燕. 自然殺傷細(xì)胞激活性和抑制性受體及其配體的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)內(nèi)科學(xué)分冊,2006, 33(1):10-13.

        10 Hou LH, Steiner NK, Chen M, et al. KIR2DL1 allelic diversity:four new alleles characterized in a bone marrow transplant population and three families[J].Tissue Antigens, 2007, 69(3):250-254.

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