吳 定，孫嘉文，黃卉卉，謝文娟，鄭溫翔

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210003)

固定化果膠酶提高蘋果出汁率的研究

吳 定，孫嘉文，黃卉卉，謝文娟，鄭溫翔

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210003)

采用固定化果膠酶處理紅富士蘋果漿，在蘋果漿pH值、固定化果膠酶水解溫度、固定化果膠酶使用質(zhì)量和固定化果膠酶水解時間對蘋果漿出汁率的影響等單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法分析，探索固定化果膠酶提高蘋果漿出汁率的最佳條件。最佳工藝條件為蘋果漿適宜pH3.43、固定化果膠酶與蘋果漿質(zhì)量比為1:15、酶促反應(yīng)溫度49.4℃、酶促反應(yīng)時間3.50h。固定化果膠酶反復(fù)使用10次時，蘋果漿的出汁率為62.421%，與對照組相比仍提高約13%。

固定化果膠酶；紅富士蘋果；出汁率；響應(yīng)面法

蘋果是世界上種植和消費最為廣泛的水果[1]，蘋果汁是世界上消費量僅次于橙汁的果汁[2]。蘋果中含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、有機酸、還原糖等營養(yǎng)物質(zhì)[3]。蘋果和蘋果制品中還含有多種生物活性物質(zhì)，如多酚以及各種食用纖維等[4-5]。蘋果汁的制取方法有壓榨、擠壓、離心和萃取[6-9]。蘋果中含有果膠，會影響蘋果的出汁率和澄清度，使用果膠酶可以提高蘋果的出汁率和澄清度，改善果汁品質(zhì)[10-15]。

固定化酶與游離酶相比，穩(wěn)定性有較大提高，對溫度和pH值的適應(yīng)范圍增大，對抑制劑和蛋白酶的敏感性降低；反應(yīng)完成后可通過簡單的方法回收酶，酶活力下降不多，并且可以重復(fù)使用，也便于產(chǎn)品的分離和純化；實現(xiàn)批量或連續(xù)操作的可能，適于產(chǎn)業(yè)化、連續(xù)化、自動化生產(chǎn)[16-21]。

目前，利用酶法提高蘋果出汁率的研究多停留在利用游離酶制劑或混合游離酶制劑的階段，也有人利用物理包埋法制備固定化果膠酶以提高蘋果出汁率[21]，但未見用化學(xué)偶聯(lián)法固定果膠酶以提高蘋果出汁率。本研究采用以戊二醛偶聯(lián)法制備的固定化果膠酶處理蘋果漿，探索提高其出汁率的最佳條件，為以化學(xué)偶聯(lián)法制備的固定化果膠酶在蘋果汁生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅富士蘋果 南京市五所村農(nóng)貿(mào)市場；固定化果膠酶 南京財經(jīng)大學(xué)生物工程實驗室自制；其他試劑均為分析純；所用水均為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

SQ2008型多功能食品加工機 上海帥佳電子科技有限公司；80-2型離心機 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；CHA-S型恒溫振蕩器 國華企業(yè)；PHS-3C型精密pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；YJ501型超級恒溫器 上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 蘋果漿的制備

選取新鮮、無害蟲、無霉?fàn)€蘋果，去除果皮和果核，切塊，用打漿機將蘋果打漿3次，每次8s，得到蘋果漿。

1.3.2 固定化果膠酶在不同條件下對蘋果出汁率的影響

稱取30g蘋果漿，調(diào)節(jié)其pH值，加入一定質(zhì)量的固定化果膠酶，在一定溫度下振蕩反應(yīng)一定時間后，取出固定化果膠酶，將處理后蘋果漿在3600r/min離心20min，測定蘋果渣質(zhì)量，計算其出汁率。

1.3.2.1 酶水解反應(yīng)溫度對蘋果漿出汁率的影響

調(diào)節(jié)蘋果漿pH3.6，分別稱取5份蘋果漿，每份30g，預(yù)熱5min后，分別加入3g固定化果膠酶，在40、45、50、55、60℃條件下振蕩反應(yīng)2.0h。然后按照上述操作，設(shè)平行實驗，計算蘋果漿的出汁率(以未加果膠酶為對照組)。

1.3.2.2 蘋果漿pH值對蘋果漿出汁率的影響

分別稱取5份蘋果漿，每份30g，調(diào)節(jié)pH值分別為3.2、3.4、3.6、3.8、4.0，預(yù)熱5min后，分別加入3g固定化果膠酶，在最適宜的溫度下振蕩反應(yīng)2.0h。然后按照上述操作，設(shè)平行實驗，計算蘋果漿的出汁率(以未加果膠酶為對照組)。

1.3.2.3 固定化果膠酶使用質(zhì)量對蘋果漿出汁率的影響

蘋果打漿，調(diào)節(jié)最適宜pH值后，分別稱取6份蘋果漿，每份30g，預(yù)熱5min后，分別加入0、1、2、3、4、5g固定化果膠酶，在最適宜的溫度下振蕩反應(yīng)2.0h。然后按照上述操作，設(shè)平行實驗，計算蘋果漿的出汁率(以未加果膠酶為對照組)。

1.3.2.4 酶水解反應(yīng)時間對蘋果漿出汁率的影響

蘋果打漿，調(diào)節(jié)最適宜pH值后，分別稱取6份蘋果漿，每份30g，預(yù)熱5min后，加入最適宜比例的固定化果膠酶，在最適宜的溫度下分別反應(yīng)0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h。然后按照上述操作，設(shè)平行實驗，計算蘋果漿的出汁率(以未加果膠酶為對照組)。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以反應(yīng)溫度、蘋果漿pH值、反應(yīng)時間為影響因素進行響應(yīng)面設(shè)計，因素水平見表1。使用最適宜比例的固定化果膠酶，以蘋果漿出汁率為響應(yīng)值，對試驗結(jié)果進行回歸分析，確定蘋果漿出汁率的最佳試驗工藝參數(shù)。

表1 固定化果膠酶提高蘋果出汁率響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素水平表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.3.4 固定化果膠酶使用次數(shù)對蘋果出汁率的影響

蘋果漿調(diào)節(jié)最適宜pH值后，分別制備10組。每組3份，每份稱取30g置于三角瓶中，其中兩份為實驗樣品，一份為對照樣品。樣品預(yù)熱5min后，兩份實驗樣本分別加入最適宜比例的固定化果膠酶振蕩反應(yīng)最適宜的時間后，將固定化果膠酶取出，再加入另一組的蘋果漿中，如此反復(fù)10次，將反應(yīng)后的蘋果漿離心，計算其出汁率(以未加果膠酶為對照組)。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化果膠酶提高蘋果出汁率單因素試驗

2.1.1 酶水解反應(yīng)溫度對蘋果漿出汁率的影響

圖1 反應(yīng)溫度對蘋果漿出汁率的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on the yield of apple juice

在40～60℃溫度范圍內(nèi)，對照組的出汁差異較小，平均為48.23%。由圖1可知，使用固定化果膠酶處理蘋果漿，在一定溫度范圍內(nèi)隨著溫度的增加，蘋果漿的出汁率逐漸增加，在45～50℃范圍內(nèi)達到最大；隨后蘋果漿出汁率降低，在55～60℃范圍內(nèi)出汁率下降速度較快，可能是由于高溫使部分果膠酶喪失活性。

2.1.2 蘋果漿pH值對蘋果漿出汁率的影響

蘋果漿pH值可影響固定化果膠酶的活性，但對對照組的出汁率幾乎沒有影響，平均出汁率為48.60%。由圖2可知，蘋果漿在pH3.4時，固定化果膠酶的作用效果最好，隨著pH值升高后，蘋果漿的出汁率逐漸降低。

圖2 蘋果漿pH值對蘋果漿出汁率的影響Fig.2 Effect of pH on the yield of apple juice

圖3 固定化果膠酶的使用質(zhì)量對蘋果漿出汁率的影響Fig.3 Effect of immobilized pectinase amount on the yield of apple juice

2.1.3 固定化果膠酶使用質(zhì)量對蘋果漿出汁率的影響由圖3可知，對照組的出汁率為48.85%，而實驗組出汁率均大于75%以上。而當(dāng)果膠酶使用質(zhì)量達到2g

水平后，過量的果膠酶并未促進出汁率的增加；固定果膠酶使用量為2g時，蘋果漿出汁率已經(jīng)達到較高水平，出汁率為80.31%。

2.1.4 酶水解反應(yīng)時間對蘋果漿出汁率的影響

圖4 反應(yīng)時間對蘋果漿出汁率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on the yield of apple juice

由圖4可知，對照組的出汁率43.76%，而在試驗時間內(nèi)蘋果漿出汁率隨著固定化果膠酶酶水解時間的增加而增加，反應(yīng)時間達到3h時，蘋果漿出汁率達到較高水平且趨于穩(wěn)定，這時出汁率達76.33%。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計試驗

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計與結(jié)果

綜合上述單因素試驗，利用Box-Behnken試驗設(shè)計原理，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。共16個試驗，包括12析因試驗和4個檢驗誤差的零點試驗。

表2 固定化果膠酶提高蘋果出汁率響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

經(jīng)多項回歸分析得到二次回歸方程：

表3 響應(yīng)面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variances for the developed quadratic regression model

對二次回歸方程模型進行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，該模型高度顯著(P=0.0001＜0.01)，失擬項(P=0.0742＞0.05)不顯著。R2=0.9886，表明蘋果漿出汁率的預(yù)測值與實際值之間有很好的擬合度。R2Adj＝0.9716，表明變異中僅有2.84%不能用模型來解釋。RSN=24.252(遠遠大于4)，因此可用此模型分析和預(yù)測固定化果膠酶在蘋果出汁率應(yīng)用中的工藝條件。該模型中，反應(yīng)溫度和蘋果漿pH值都為顯著影響因素，三因素對固定化果膠酶活力的影響順序為蘋果漿pH值＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時間。

2.2.2 響應(yīng)面分析

圖5 各兩因素交互作用對蘋果漿出汁率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the interactive effects of three hydrolysis parameters on the yield of apple juice

由圖5a可知，反應(yīng)時間為3.00h，當(dāng)溫度一定時，蘋果漿的出汁率隨著pH值的增加先增加后減?。划?dāng)pH值一定時，隨著溫度的升高，蘋果漿的出汁率隨著溫度的增加也是先增加后減小；在pH3.40、50℃時出汁率達到最大。由圖5b可知，pH值為3.40，當(dāng)溫度一定時，蘋果漿的出汁率隨著反應(yīng)時間的延長，先降低后增加但變化較小，說明反應(yīng)時間對出汁率的影響較??；在反應(yīng)時間一定時，蘋果漿出汁率隨著溫度的增加先增加后降低；在溫度50℃，反應(yīng)時間3.00h時達到最大。由圖5c可知，反應(yīng)溫度為50℃，當(dāng)pH值一定時，蘋果漿的出汁率隨著反應(yīng)時間的延長，先降低后增加但變化較小，說明反應(yīng)時間對出汁率的影響較小；在反應(yīng)時間一定時，蘋果漿的出汁率隨著pH值的增加先增高后降低；在pH3.40，反應(yīng)時間為3.00h時達到最大。

2.3 最優(yōu)工藝及驗證實驗

利用Expert軟件，解響應(yīng)面二次回歸方程，當(dāng)出汁率達最大值(79.53%)時，最大值點(A，B，C)＝(－0.124，0.15，1.0)，換算為實際工藝參數(shù)(反應(yīng)溫度49.4℃、蘋果漿pH3.43、反應(yīng)時間3.50h)。

進行回歸模型可靠性驗證實驗，設(shè)計兩組平行實驗。進行兩組平行實驗得到蘋果漿出汁率為78.40%，與模型預(yù)測值吻合度較高，進一步驗證了該模型的可行性。

2.4 固定化果膠酶使用次數(shù)對蘋果漿出汁率的影響

圖6 固定化果膠酶使用次數(shù)對蘋果漿出汁率的影響Fig.6 Effect of number of repeated uses of immobilized pectinase on the yield of apple juice

由圖6可知，固定化果膠酶在第4次使用時，果膠酶活力下降較多，果膠酶在使用4次后蘋果漿出汁率由78.40%降到65.08%，在以后的使用中，蘋果漿的出汁率略微下降。在第10次使用時蘋果漿出汁率仍然達到62.42%，與對照組(49.09%)相比，出汁率仍提高約13%。

3 結(jié) 論

3.1 單因素試驗結(jié)果表明，反應(yīng)溫度50℃、蘋果漿pH3.40、固定化果膠酶與蘋果漿質(zhì)量比1:15，反應(yīng)時間3h時，固定果膠酶對蘋果漿的處理效果最好。

3.2 通過響應(yīng)面法分析，建立固定化果膠酶提高蘋果漿出汁率的工藝參數(shù)模型，回歸方程決定系數(shù)為

0.9886，模型顯著，擬合度好，具有實際指導(dǎo)意義。得到最佳工藝為反應(yīng)溫度49.4℃、蘋果漿pH3.43、反應(yīng)時間3.50h。在該工藝條件下處理蘋果漿，固定化果膠酶在使用第10次時，蘋果漿的出汁率為62.42%，比對照組出汁率提高約13%。

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Improvement of Apple Juice Yield Using Immobilized Pectinase

WU Ding，SUN Jia-wen，HUANG Hui-hui，XIE Wen-juan，ZHENG Wen-xiang
(College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China)

Immobilized pectinase was used to treat Red Fuji apple pulp to improve juice yield. One-variable-at-a-time experiments were conducted to investigate the effects of pH, hydrolysis temperature, enzyme dose and hydrolysis time on juice yield. Further, response surface methodology was employed to optimize the hydrolysis parameters. The optimal hydrolysis conditions were found as follows: pH 3.43, 1:15 of enzyme/substrate ratio, 49.4 ℃ of hydrolysis temperature, and 3.50 h of hydrolysis time. After tenth repeated use, the immobilized enzyme resulted in a juice yield of 62.421%, which was increased by approximately 13% compared with the control.

immobilized pectinase；Red Fuji apple；apple juice yield；response surface methodology

Q814.9

A

1002-6630(2012)16-0040-05

2011-07-04

江蘇省教育廳實踐創(chuàng)新項目(SJ0913)

吳定(1962—)，男，教授，碩士，主要從事食品生物工程研究。E-mail：Foodfermentation@163.com