朱立鑫，裘雪梅，陳興龍，劉仁榮,*，徐 玲，徐富勇

(1.江西科技師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013；2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330047)

蘇丹紅Ⅰ免疫親和柱的研制與鑒定

朱立鑫1,2，裘雪梅1，陳興龍1,2，劉仁榮1,*，徐 玲1，徐富勇1,2

(1.江西科技師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013；2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330047)

以羧基化的瓊脂糖凝膠4FF為載體，采用碳化二亞胺法偶聯(lián)抗蘇丹紅Ⅰ(SudanⅠ)單克隆抗體，制備蘇丹紅Ⅰ免疫親和柱(IAC)。將SudanⅠ樣品過免疫親和柱，乙腈洗脫后以高效液相色譜法(HPLC)檢測，紫外檢測波長為478nm，流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈-0.1%甲酸乙腈溶液-丙酮(體積比為21.25:3.75:60:15)。抗SudanⅠ單克隆抗體免疫親和柱以0.3g帶羧基的瓊脂糖凝膠4FF與1mg SudanⅠ單抗偶聯(lián)，柱容量為1.6μg。辣椒粉以0.25～3mg/kg水平添加SudanⅠ標(biāo)準(zhǔn)品，平均回收率為44.52%～77.40%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%～8.3%。信噪比(RSN)為3:1時的最低檢測限為15ng/mL。本實(shí)驗(yàn)成功制備出蘇丹紅免疫親和柱。

蘇丹紅；免疫親和柱；高效液相色譜

蘇丹紅Ⅰ(SudanⅠ)是人工合成的屬于非離子型脂溶性偶氮類化合物中的一種有機(jī)染色劑[1]，由于其價格低廉，染色效果好，常被廣泛地應(yīng)用于工業(yè)產(chǎn)品中[2-3]。動物實(shí)驗(yàn)表明蘇丹紅Ⅰ具有潛在的致癌性，能導(dǎo)致膀胱、肝臟、脾臟等器官腫瘤[4-5]，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)歸為3類致癌物，已被禁止作為食品添加劑使用[6-9]。

目前，各國學(xué)者建立了多種檢測蘇丹紅Ⅰ的方法，主要有酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法(ELISA)[7-10]、液相色譜法(LC-UV-VIS)[11]和液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)[5]。還有一些方法，如毛細(xì)管膠束電泳色譜法聯(lián)紫外檢測器法(MEKC-UV)[2]、液相色譜電噴霧聯(lián)質(zhì)譜儀法(LC-ESI-MS)[12]、分子印跡聚合物的固相萃取聯(lián)高效液相色譜法(MIP-SPE-HPLC)[13]、高效液相色譜聯(lián)電化學(xué)法(HPLC-EC)[14]、電化學(xué)法(CPE)[15]和毛細(xì)管液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿加速飛行時間質(zhì)譜(CLC-ES-QO-MS)[16]等，ELISA法檢測蘇丹紅的最低檢測限小于1ng/mL，HPLC法的最低檢測限小于10μg/kg，LC-MS法的最低檢測限小于10μg/L。ELISA法快速、靈敏，對樣品純度要求低，但干擾因素多，重復(fù)性差，常用于大批量樣品的檢測[17]；EC檢測法靈敏度較差；HPLC、LC-MS、LC-MS/MS靈敏、準(zhǔn)確，但對樣品純度要求較高，檢測前必須對樣品進(jìn)行凈化處理，常規(guī)凈化法步驟繁雜，且需使用大量有機(jī)溶劑，危害操作人員的身體健康。免疫親和柱凈化法是利用抗原抗體高度特異性親和吸附作用，使固定在載體上的抗體能快速特異地將蘇丹紅Ⅰ從樣品中分離，并同時完成凈化和濃縮步驟。

本實(shí)驗(yàn)以羧基化的瓊脂糖凝膠4FF為載體，制備蘇丹紅Ⅰ免疫親和柱，并凈化加標(biāo)樣品，通過HPLC-UV對凈化效果進(jìn)行鑒定。免疫親和柱簡便、快速、高效的樣品前處理方式，為HPLC、MS等精確檢測各種樣品提供了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒粉 市售；抗SudanⅠ單克隆抗體小鼠腹水、羧基化的Sepharose 4FF 實(shí)驗(yàn)室自制。

SudanⅠ、碳化亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl) 美國Sigma公司；乙腈、甲醇(色譜純) 上海陸都化學(xué)試劑廠；丙酮(色譜純) 汕頭市西隴化工廠有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Millipore制備的超純水。

PBS緩沖液： NaCl 8.0g、 Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCl 0.2g、KH2PO40.2g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Lambda 35紫外分光光度計(jì) Perkin Elmer公司；PowerPac Basic Power Supply蛋白質(zhì)電泳儀 美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng) 英國Syngene公司；ZHWY-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；Agilent 1100高效液相色譜 美國安捷倫公司；超純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 SudanⅠHPLC檢測方法的建立[18]

HPLC條件：C18反相色譜柱ODS Hypersil (2.1mm×100mm，5μm)；進(jìn)樣量：20μL；流速：1mL/min；柱溫：30℃；紫外檢測器：478nm；流動相：A相、B相體積比25:75 (A：0.1%甲酸的水溶液、乙腈體積比85:15，B：0.1%甲酸的乙腈溶液、丙酮體積比80:20)。

SudanⅠHPLC檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：20μL不同質(zhì)量濃度的SudanⅠ標(biāo)準(zhǔn)溶液(先用N,N-二甲基甲酰胺配成1mg/mL，然后用乙腈稀釋成4000、3000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.25ng/mL)用 HPLC檢測，每個質(zhì)量濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，根據(jù)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以RSN為3:1時的蘇丹紅質(zhì)量濃度作為最低檢測限。

1.3.2 抗SudanⅠ單克隆抗體小鼠腹水的制備[17]、純化和鑒定[19-20]

抗SudanⅠ單克隆抗體小鼠腹水的制備參考文獻(xiàn)[17]，其純化和鑒定參考[19-20]方法進(jìn)行。

1.3.3 抗SudanⅠ單克隆抗體瓊脂糖凝膠4FF的制備

將羧基化的的瓊脂糖凝膠4FF置于砂芯漏斗中，用蒸餾水沖洗，真空泵抽干，稱取1g，加入1mg抗SudanⅠ單抗、EDAC和超純水，于室溫，180r/min振蕩反應(yīng)12h。以此同時，用氨基化蘇丹紅與抗SudanⅠ單抗做對照，觀察反應(yīng)偶聯(lián)效果。然后再加入pH 8.0 0.1mol/L Tris-HCl封阻緩沖液，繼續(xù)反應(yīng)3h。

將偶聯(lián)有單抗的瓊脂糖凝膠4FF，先用PBS洗3次，然后用pH 3.6 0.1mol/L醋酸緩沖液含0.5mol/L NaCl和pH 8.0、0.1mol/L Tris-HCl緩沖液含0.5mol/L NaCl交替洗至少3次，再用PBS洗3次，最后用0.2g/L NaN3的PBS洗2次，將凝膠保存于4℃，0.2g/L NaN3的PBS中。

將偶聯(lián)有氨基化蘇丹紅的瓊脂糖凝膠4FF，先用0.01mol/L HCl洗至少3次，每次振蕩混勻，以1000r/min離心3min，棄上清；再用乙腈和PBS緩沖液分別洗3次，方法同上。然后，將其加入PB S緩沖液，4℃保存。

1.3.4 免疫親和柱凈化樣品

將保存于4℃、0.2g/L NaN3-PBS中的抗SudanⅠ單抗-Sepharose 4FF平衡至室溫后脫氣，裝柱后，先用PBS緩沖液平衡；然后以20%乙腈-PBS作為上樣緩沖液，上樣一次；再用PBS緩沖液清洗至少10倍柱床體積，以1滴1～2s速度過柱；最后用3.0mL乙腈洗脫，收集洗脫液。立即將柱子用PBS緩沖液清洗至少3次，然后用pH 3.6、0.1mol/L醋酸緩沖液含0.5mol/L NaCl和pH 8.0、0.1mol/L Tris-HCl緩沖液含0.5mol/L NaCl交替洗至少3次，再用PBS緩沖液洗3次，將凝膠保存于4℃、0.2g/L NaN3的PBS中。

1.3.5 免疫親和柱性能的測定和IAC條件的優(yōu)化

1.3.5.1 上樣緩沖液的選擇

取0.3g 抗SudanⅠ單抗-Sepharose 4FF裝柱，共3批，每批4支，同時上樣1.8μg SudanⅠ標(biāo)準(zhǔn)品，上樣緩沖液分別為8mL 15%、20%、25%、30%乙腈-PBS，3.0mL乙腈洗脫，HPLC檢測洗脫液。

1.3.5.2 洗脫液體積的選擇

取抗SudanⅠ單抗的Sepharose 4FF親和柱6支(共3批，每批6支)，同時上樣，上樣量為1.8μg SudanⅠ標(biāo)準(zhǔn)品，然后分別用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL乙腈洗脫，收集洗脫液，并用HPLC檢測。

1.3.5.3 免疫親和填料裝柱量、上樣量與柱容量的關(guān)系

填料裝柱量與柱容量的關(guān)系：取1支柱子(共3批，每批1支)，用0.6g 抗SudanⅠ單抗的Sepharose 4FF裝柱，上樣量為1.8μg SudanⅠ標(biāo)準(zhǔn)品，用3.0mL乙腈洗脫并吹干，收集洗脫液，用HPLC檢測。

上樣量與柱容量的關(guān)系：取0.3g抗SudanⅠ單抗的Sepharose 4FF裝柱，4支(共3批，每批4支)，上樣量分別為1、2、3、4μg SudanⅠ標(biāo)準(zhǔn)品，用3.0mL乙腈洗脫，分別收集洗脫液，并用HPLC檢測。

柱容量的測定：取1支柱子(共3批，每批1支)，用0.3g 抗SudanⅠ單抗的Sepharose 4FF裝柱，上樣量為1.8μg SudanⅠ標(biāo)準(zhǔn)品，用3.0mL乙腈洗脫，收集洗脫液，并用HPLC檢測。

1.3.5.4 免疫親和柱穩(wěn)定性的測定

洗脫液對免疫親和柱的影響：取0.3g 抗SudanⅠ單抗的Sepharose 4FF裝柱，上樣量為1.8μg SudanⅠ標(biāo)準(zhǔn)品，洗脫并收集洗脫液。柱子平衡和再生后，再重復(fù)以上步驟兩次。用HPLC檢測洗脫液。

1.3.6 辣椒粉樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

稱取1g辣椒粉陰性樣品(經(jīng)HPLC和ELISA法檢測都為陰性)，分別加入250、500、1000、2000、3000ng SudanⅠ標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度做3個平行樣；加入5mL乙腈，然后振蕩(或超聲)10min，離心15min，取上清3.6mL濃縮至1mL左右，接著再用乙腈定容至1.6mL，再加6.4mL PBS，混勻后，用定性濾紙過濾。然后取濾液6.6mL過免疫親和柱(每支用0.3g抗SudanⅠ單抗的Sepharose 4FF裝柱，柱容量約為1000ng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SudanⅠHPLC檢測方法的建立

在本實(shí)驗(yàn)條件下，SudanⅠ的HPLC保留時間為7.973min，如圖1所示。

圖1 4000ng/mL SudanⅠ標(biāo)品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of Sudan I standard at 4000 ng/mL

分析不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC檢測結(jié)果，在質(zhì)量濃度為31.25～4000ng/mL時，峰面積與SudanⅠ質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，且標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.07422.6395(R2＝0.9998)。該方法的最低檢測限為15ng/mL(RSN＝ 3:1)。

2.2 小鼠腹水中SudanⅠ單抗純化效果的評價

2.2.1 辛酸-硫酸銨法純化腹水中單抗的回收率

使用紫外分光光度計(jì)紫外掃描小鼠腹水和腹水純化后抗體中蛋白質(zhì)量濃度分別為27.29mg/mL和7.17mg/mL，它們體積分別為4.0mL和4.05mL，蛋白回收率為26.60%。

2.2.2 抗SudanⅠ單克隆抗體純度的測定

圖2 抗SudanⅠ單克隆抗體純化前后SDS-PAGE電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE pattern of ascites and purified anti-Sudan I monoclonal antibody

由圖2可知，原始腹水的蛋白成分復(fù)雜，經(jīng)純化后的抗體蛋白較單一，說明抗體純度較高。

2.2.3 純化后抗SudanⅠ單抗活性的測定

采用間接非競爭ELISA，以BSA-SudanⅠ3μg/mL為檢測抗原包被，原始腹水和純化后抗體在相同比例稀釋下，在光密度值為1.2時，原始腹水和純化后的單抗效價分別為1:1.28×105、1:6.4×104，對比可知，單抗純化的活性回收率較高。

2.3 抗SudanⅠ單克隆抗體免疫親和柱的制備

氨基化蘇丹紅和抗SudanⅠ單克隆抗體在相同的條件下分別與羧基化的瓊脂糖凝膠4FF反應(yīng)，若氨基化蘇丹紅偶聯(lián)效果很好，說明在此條件下偶聯(lián)上的單抗量也較多。

偶聯(lián)有氨基化蘇丹紅的羧基化瓊脂糖凝膠4FF，經(jīng)洗凈后，由凝膠顏色的深淺可看出，在EDAC終質(zhì)量濃度為19mg/mL，17℃、180r/min振蕩反應(yīng)12h時偶聯(lián)效果好。

2.4 免疫親和柱性能的測定和IAC條件的優(yōu)化

2.4.1 上樣緩沖液和上樣方式的選擇

SudanⅠ難溶于水，為增加其溶解量，用乙腈等有機(jī)溶劑溶解，但有機(jī)溶劑又會破壞單抗的活性，因此需探尋上樣緩沖液中乙腈比例與SudanⅠ回收率的關(guān)系，盡可能地使SudanⅠ與固定的單抗結(jié)合，其關(guān)系，如圖3所示，上樣緩沖液為20%乙腈-PBS時，SudanⅠ回收率最大。

圖3 上樣緩沖液與SudanⅠ回收率的關(guān)系Fig. 3 Effect of loading buffer concentration on recovery rate of Sudan I

2.4.2 洗脫液體積的選擇

取0.3g抗SudanⅠ單抗的Sepharose 4FF裝柱量，上樣量為1.8μg SudanⅠ，SudanⅠ回收率與乙腈洗脫液關(guān)系。如圖4所示，SudanⅠ回收率在洗脫液乙腈的體積從0.5～1.0mL時，出現(xiàn)劇增，從1.0～3.0mL時，增幅較小。故本實(shí)驗(yàn)選擇3.0mL乙腈作為洗脫液。

圖4 洗脫液體積與SudanⅠ洗脫率的關(guān)系Fig. 4 Effect of eluent dose on elution rate of Sudan I

2.4.3 免疫親和柱填料裝柱量、上樣量與柱容量的關(guān)系

免疫親和柱填料裝柱量與柱容量的關(guān)系：0.6g抗SudanⅠ單抗-Sepharose 4FF，上樣量為2 μg SudanⅠ時，1mL乙腈洗脫，SudanⅠ回收率為43.93%，比裝柱量為0.3g的回收率低。原因是裝柱量增大，增加柱床高度，從而也增加了SudanⅠ吸附距離，在洗脫液體積為1.0mL時，并不能完全把結(jié)合上的SudanⅠ洗脫，最終導(dǎo)致低于0.3g裝柱量的回收率。

上樣量與柱容量關(guān)系：同批免疫親和填料0.3g，僅上樣量不同，用3mL乙腈洗脫后，經(jīng)HPLC檢測，發(fā)現(xiàn)上樣量和柱容量的關(guān)系。柱容量的測定：0.3g免疫親和填料，在優(yōu)化條件下，即SudanⅠ上樣量為1.8μg，20%的乙腈-PBS作為上樣緩沖液，僅上樣一次，測得柱容量為1582.8ng，SudanⅠ回收率為87.93%。由圖5可知，在3mL乙腈洗脫下，SudanⅠ上樣量達(dá)到2μg時，再增加上樣量，測出的柱容量基本上保持穩(wěn)定。

圖5 SudanⅠ上樣量與柱容量的關(guān)系Fig. 5 Effect of loading amount of Sudan I on IAC capacity

2.4.4 免疫親和柱穩(wěn)定性的測定

免疫親和柱每次上樣量為1.8μg，僅上樣一次，上樣緩沖液為25%乙腈-PBS，3.0mL乙腈作為洗脫液。第一次上樣，清洗，洗脫后，立即再生，接著重復(fù)此步驟兩次，以消除保存方法和保存時間對免疫親和填料的影響，考察洗脫液對免疫親和填料中單抗的破壞程度。如圖6所示，每使用一次，SudanⅠ回收率約降低12%，即柱容量降低216ng，說明免疫親和柱穩(wěn)定性較好，可以重復(fù)使用。

圖6 免疫親和柱穩(wěn)定性與SudanⅠ回收率的關(guān)系Fig. 6 Effect of number of repeated uses on recovery rate of Sudan I

2.5 辣椒粉樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

表1 辣椒粉樣品SudanⅠ標(biāo)品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)Table 1 Recovery rates of Sudan I in chili powder samples spiked with Sudan I standard

選用柱容量約為1000ng的免疫親和柱進(jìn)行樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。將加有不同量SudanⅠ標(biāo)準(zhǔn)品的辣椒粉樣品，經(jīng)乙腈提取并用PBS緩沖液稀釋至20%乙腈-PBS后，過免疫親和柱，用建立的HPLC法檢測洗脫液中SudanⅠ的含量，由表1可知，測得辣椒粉中SudanⅠ的回收率為44.52%～77.40%，變異系數(shù)為4.6%～8.3%，表明蘇丹紅Ⅰ免疫親和柱研制成功。

3 討 論

采用碳化亞二胺法，以本實(shí)驗(yàn)室制備的羧基化瓊脂糖凝膠4FF為載體與抗蘇丹紅Ⅰ單抗偶聯(lián)，成功地制備了蘇丹紅Ⅰ免疫親和柱。免疫親和柱柱容量約為1600ng。通過樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)表明，在加標(biāo)量未超過柱容量時，蘇丹紅Ⅰ回收率大于70%，最低檢測限為15ng/mL(RSN＝3:1)。蘇丹紅Ⅰ免疫親和柱經(jīng)多次使用后，蘇丹紅Ⅰ回收率每次降低12%，說明免疫親和柱基本穩(wěn)定，能重復(fù)利用。由于羧基化瓊脂糖凝膠的制備和辛酸-硫酸銨法純化的單抗，不同批次有所差別，使免疫親和柱柱容量在微小范圍內(nèi)波動，但蘇丹紅Ⅰ回收率幾乎不變。蘇丹紅的物理吸附性強(qiáng)，易吸附于免疫親和柱的篩板和柱壁上，且上樣量大時，吸附上的蘇丹紅也相應(yīng)的增多，吸附的蘇丹紅經(jīng)有機(jī)溶劑和超聲處理仍難以洗脫，導(dǎo)致實(shí)際上樣量偏低，從而使回收率遠(yuǎn)低于真實(shí)值。因此，羧基化瓊脂糖凝膠4FF活化率的提高，單抗的偶聯(lián)條件和蘇丹紅上樣條件(上樣緩沖液的鹽濃度和pH值、上樣體積、洗脫速度、溫度)的進(jìn)一步優(yōu)化，增加蘇丹紅結(jié)合率降低物理性吸附率，以及制備高親和力的抗蘇丹紅Ⅰ單抗，為增大柱容量、提高蘇丹紅回收率提供可能。

目前，國內(nèi)外均無抗蘇丹紅免疫親和柱研制的報(bào)導(dǎo)，本實(shí)驗(yàn)成功制備的抗蘇丹紅Ⅰ免疫親和柱填補(bǔ)了這份空白。免疫親和柱特異性強(qiáng)、簡便快速、安全、回收率高的樣品凈化處理方式，為高效液相色譜-質(zhì)譜儀準(zhǔn)確、快速地檢測各種蘇丹紅樣品提供了良好的基礎(chǔ)，顯示了很好的應(yīng)用前景。

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Preparation and Identification of Sudan I Immunoaffinity Column

ZHU Li-xin1,2，QIU Xue-mei1，CHEN Xing-long1,2，LIU Ren-rong1,*，XU Ling1，XU Fu-yong1,2
(1. College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China ；2. College of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

A Sudan I immunoaffinity chromatographic column (IAC) was prepared by carbodiimide method, in which a modified Sepharose 4FF containing carboxyl group was used as the carrier to couple with a monoclonal antibody against Sudan I. A reversed-phase HPLC method was established to determine Sudan I using a mobile phase composed of 0.1% formic wateracetonitrile-0.1% formic acetonitrile-acetone (21.25:3.75:60:15, V/V) at a flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was 478 nm. The retention time of Sudan I was found to be 7.97 min. The prepared IAC column as a conjugate between 0.3 g of Sepharose 4FF and 1 mg of purified anti-Sudan I monoclonal antibody showed a capacity of 1.6μ g. The average recovery rates of Sudan I from chili powder spiked with Sudan I standard at levels varying from 0.25 to 3 mg/kg was 44.52%～77.40% with relative standard deviation of 4.6%～8.3%. The detection limit was 15 ng/mL based on a signal-to-noise ratio of 3:1. Therefore, a Sudan I IAC column has been prepared successfully.

Sudan I；immunoaffinity column；high performance liquid chromatography (HPLC)

O658；TS207.3

A

1002-6630(2012)15-0252-05

2011-06-02

江西省教育廳科技專項(xiàng)(GJJ10595)

朱立鑫(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zhulixin007@163.com

*通信作者：劉仁榮(1969—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測。E-mail：lilirenrong@hotmail.com