張媛媛，李家洲

(1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東 廣州 510300；2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510300)

基因組改組快速提高谷氨酸棒桿菌L-鳥氨酸產(chǎn)量

張媛媛1,2，李家洲1

(1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東 廣州 510300；2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510300)

以谷氨酸棒桿菌ATCC13032為出發(fā)菌，應(yīng)用基因組改組技術(shù)快速提高L-鳥氨酸產(chǎn)量。經(jīng)過紫外線、亞硝基胍和甲基磺酸乙酯分別誘變處理，獲得6株產(chǎn)量有所提高的突變株，以此構(gòu)建用于基因組改組的候選菌庫。考察培養(yǎng)基成分對原生質(zhì)體再生率的影響。經(jīng)過兩輪的滅活原生質(zhì)體遞推式融合，以磺胺胍和氟化鈉為雙抗性篩選標(biāo)記，共篩選出2株遺傳性能穩(wěn)定的改組菌株。其中改組菌株F2-6搖瓶發(fā)酵72h，積累L-鳥氨酸產(chǎn)量為2.99g/L，是出發(fā)菌株的13.6倍。結(jié)果表明基因組改組技術(shù)能夠在短期內(nèi)使谷氨酸棒桿菌的L-鳥氨酸產(chǎn)量得以提高。

基因組改組；谷氨酸棒桿菌；L-鳥氨酸；產(chǎn)量

L-鳥氨酸在生物體內(nèi)主要參與尿素循環(huán)，對氨態(tài)氮的排出有重要作用[1]。近年來，L-鳥氨酸在醫(yī)藥和食品行業(yè)均有廣泛用途[2]。在醫(yī)藥工業(yè)，L-鳥氨酸除了主要用于保肝、護肝及治療高血氨癥外[3]，還可用于外傷和燒傷的恢復(fù)[4]；在食品行業(yè)，L-鳥氨酸既有保健減肥的功效又能提高機體免疫力，是健美者和運動員的理想營養(yǎng)補劑。L-鳥氨酸的多功能保健作用不斷引起人們的關(guān)注，其市場需求日益劇增。但L-鳥氨酸的生產(chǎn)較為困難，目前L-鳥氨酸的生產(chǎn)主要有酶法和發(fā)酵法。酶法是精氨酸在精氨酸酶的作用下，轉(zhuǎn)化生成L-鳥氨酸。此法雖然產(chǎn)品純度高，但精氨酸和精氨酸酶都難于獲得，導(dǎo)致生產(chǎn)成本過高[5]。而發(fā)酵法則簡單易行，特別適合于工業(yè)化生產(chǎn)。目前，應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的菌株大都是通過傳統(tǒng)誘變育種獲得，生產(chǎn)性能不穩(wěn)定，給企業(yè)帶來較大的困擾。最近，國際上開始了L-鳥氨酸代謝工程方面的研究[6-8](從分子水平上構(gòu)建L-鳥氨酸工程菌)并取得了一定的進展，但菌株基因組信息和代謝網(wǎng)絡(luò)信息的欠缺限制了研究者對L-鳥氨酸生產(chǎn)菌的進一步改造。

基因組改組技術(shù)是DNA改組技術(shù)在全基因組水平的延伸，可將多親本的優(yōu)良基因整合在一起。自Zhang Yingxin等[9]首次提出該技術(shù)以來，該技術(shù)已成功應(yīng)用于諸多研究中以提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量[10]，增強微生物對環(huán)境的耐受性[11-12]以及底物利用范圍[13]，甚至誘導(dǎo)微生物分泌新的代謝產(chǎn)物[14]等?；蚪M改組技術(shù)不僅具有篩選周期短、正突變率高、避免對誘變劑產(chǎn)生“鈍化”等優(yōu)點，而且還將為功能基因組學(xué)的研究及揭示基因型和表型的關(guān)系提供素材[15]。本實驗以谷氨酸棒桿菌ATCC13032(其基因組序列已公布GI號為42602314)為出發(fā)菌，應(yīng)用基因組改組技術(shù)快速提高其L-鳥氨酸產(chǎn)量，為探索谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-鳥氨酸的代謝機制及進一步構(gòu)建L-鳥氨酸高產(chǎn)菌提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicumATCC 13032)，為本實驗室保存菌種。

1.1.2 試劑

L-鳥氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(日本進口分裝) 上海伯奧生物科技有限公司；亞硝基胍(NTG) 美國Fluka公司；磺胺胍(SG)、甲基磺酸乙酯(EMS) 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

完全培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和抗性篩選培養(yǎng)基參照文獻[16]。

再生培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1、蛋白胨10、牛肉膏10、酵母粉5、NaC1 5、丁二酸鈉135、MgCl22，pH 7.0，上層培養(yǎng)基瓊脂粉質(zhì)量濃度為8g/L，下層培養(yǎng)基瓊脂粉質(zhì)量濃度為18g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌種誘變方法

利用紫外線(UV)及NTG誘變，參照文獻[16]方法。

EMS誘變：取100μL EMS和9.9mL菌懸液于滅菌離心管中，200r/min作用30min，用等體積20g/L的硫代硫酸鈉終止反應(yīng)。洗滌后，轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h。梯度稀釋后分別取樣0.1mL均勻涂布于抗性篩選平板上，于32℃培養(yǎng)2～3d。

1.2.2 篩選方法

初篩：將抗性篩選培養(yǎng)基上生長良好的單菌落接入發(fā)酵培養(yǎng)基(250mL三角瓶裝液量30mL)中，32℃、200r/min振蕩培養(yǎng)72h，測發(fā)酵液中L-鳥氨酸產(chǎn)量。

復(fù)篩：將初篩產(chǎn)量較高的菌株，先接入種子培養(yǎng)基(250mL三角瓶裝液量 30mL)，32℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12h，再按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中32℃，200r/min振蕩培養(yǎng)72h，發(fā)酵結(jié)束后，測其發(fā)酵液中L-鳥氨酸產(chǎn)量。每次平行實驗3次。

1.2.3 原生質(zhì)體的制備

取1環(huán)新鮮活化的谷氨酸棒桿菌，接入種子培養(yǎng)基中，30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)24h；取1mL菌液于種子培養(yǎng)基中(250mL三角瓶裝液量 30mL)，培養(yǎng)3h，加入終濃度為0.6U/mL青霉素繼續(xù)培養(yǎng)3h，取上述培養(yǎng)的菌液10mL于4℃、4000r/min離心15min，去上清液，洗滌2次，再加入終質(zhì)量濃度為1mg/mL的溶菌酶，于32℃處理2 h，洗滌后備用。

1.2.4 原生質(zhì)體的再生和融合

原生質(zhì)體的再生、融合及再生率的計算，參照文獻[17]方法進行。

1.2.5 基因組改組

將候選菌庫中的菌株都制備成原生質(zhì)體，混合后分成兩等份，分別進行紫外滅活和55℃熱滅活。取滅活后的原生質(zhì)體懸浮液各2.5mL于無菌試管中融合。融合后的菌液進行梯度稀釋，取0.2mL用夾層法培養(yǎng)于再生平板上，32℃培養(yǎng)至長出菌落。經(jīng)初篩和復(fù)篩，所得L-鳥氨酸產(chǎn)量提高的幾株菌株，作為下一輪基因組改組的親本。

1.2.6 菌株遺傳穩(wěn)定性的檢驗

將F2代菌株分別用新鮮的抗性篩選斜面培養(yǎng)基連續(xù)傳代6次，1～6代菌株一同進行搖瓶發(fā)酵，每代菌株平行發(fā)酵3次，于發(fā)酵72h測定L-鳥氨酸產(chǎn)量，比較每一代菌株的發(fā)酵結(jié)果，考察其遺傳穩(wěn)定性。

1.2.7L-鳥氨酸產(chǎn)量及生物量的測定

參照文獻[8]方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選菌庫的構(gòu)建

圖1 候選菌庫中菌株的L-鳥氨酸產(chǎn)量Fig.1 L-Ornithine yield of the starting ATCC13032 strain and some mutants

選用SG和氟化鈉(NaF)為抗性篩選標(biāo)記。在含0.5g/L SG和0.8g/L NaF抗性平板上，隨機挑選240株菌株進行初篩，再復(fù)篩，共獲得63株L-鳥氨酸產(chǎn)量有所提高的突變菌株。選取每種誘變劑誘變結(jié)果最好的2株菌株，共6株(N2、N5、U11、U48、E14和E30)構(gòu)成候選菌庫。由圖1可知，此6株菌株的L-鳥氨酸平均產(chǎn)量為0.97g/L，約為出發(fā)菌株ATCC 13032產(chǎn)量(0.22g/L)的4.4倍。

2.2 再生培養(yǎng)基的優(yōu)化

表1 DMSO和CaCl2的添加對谷氨酸棒桿菌ATCC 13032 原生質(zhì)體再生率的影響Table 1 Effects of DMSO and CaCl2 in the medium on the regeneration rate of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 protoplasts

向再生培養(yǎng)基添加不同量的DMSO和CaCl2，考察其對ATCC 13032 原生質(zhì)體再生率的影響。由表1可知，DMSO和CaCl2的添加均可顯著提高原生質(zhì)體再生率，當(dāng)再生培養(yǎng)基中同時添加3g/L的CaCl2和10mL/L的DMSO時，原生質(zhì)體再生率最高可達34%，較未添加時提高了1.125倍。

2.3 融合子的篩選

圖2 紫外線照射時間及55℃熱作用時間對谷氨酸棒桿菌原生質(zhì)體致死率的影響Fig.2 Effects of UV irradiation and heating at 55 ℃ on the survival of Corynebacterium glutamicum protoplasts

將融合子的再生與抗性篩選分步操作(即原生質(zhì)體融合后先再生，待長出菌落后再轉(zhuǎn)接于抗性平板上)，并同時采用多親本滅活法進一步提高篩選效率。由圖2可知，候選菌庫中菌株的原生質(zhì)體致死率達100%時，需紫外線照射25min或55℃熱處理120min。多親本滅活法與原生質(zhì)體再生、抗性篩選分步操作相結(jié)合，篩選產(chǎn)量提高的融合子的速度大為提高。

2.4 兩輪基因組改組菌株產(chǎn)L-鳥氨酸的比較

以候選菌庫中的6株菌株為出發(fā)菌株，進行第一輪改組。經(jīng)誘變后的菌株獲得了新的遺傳性狀，耐受SG和 NaF的能力也發(fā)生了變化，因此抗性平板中這兩種物質(zhì)的質(zhì)量濃度也要隨之調(diào)整。第一輪改組后所用抗性平板中的SG和 NaF質(zhì)量濃度分別提高至0.7g/L及1.0g/L(候選菌庫中的菌株在此質(zhì)量濃度條件下均不能生長)。在此抗性平板上長出的菌落中隨機挑選80株菌株進行初篩，再復(fù)篩，得到L-鳥氨酸產(chǎn)量進一步提高的第一代改組菌株：F1-3、F1-8、F1-12、F1-23、F1-56、F1-77，其平均L-鳥氨酸產(chǎn)量達1.92g/L，比候選菌庫中菌株的平均產(chǎn)量提高96%，如圖3所示。以此為F1代6株菌株再次進行基因組改組，結(jié)果獲得4株產(chǎn)量有所提高的第二代改組菌株：F2-6、F2-21、F2-23、F2-29，其L-鳥氨酸產(chǎn)量(2.85g/L)比第一代改組菌株平均產(chǎn)量提高50%，其中F2-6產(chǎn)量最高達2.99g/L，是原始菌谷氨酸棒桿菌ATCC 13032L-鳥氨酸產(chǎn)量的13.6倍。

圖3 基因組改組菌與原始菌發(fā)酵產(chǎn)L-鳥氨酸的比較Fig.3 Comparison of L-ornithine yield between the starting wide-type strain and genome shuffled mutants

2.5 F2代改組菌的遺傳穩(wěn)定性

為保證菌株在傳代過程中不受培養(yǎng)基的影響，本實驗以抗性篩選培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基，將F2代4株菌株分別傳代至第6代，再同時進行L-鳥氨酸搖瓶發(fā)酵。由表2可知，F(xiàn)2-21和F2-23分別在傳至第3代及第4代出現(xiàn)突變，產(chǎn)量下降明顯。F2-6和F2-29產(chǎn)酸較穩(wěn)定，其中F2-6產(chǎn)量最高，傳6代，平均產(chǎn)L-鳥氨酸為2.93g/L?？梢?，改組菌也有遺傳不穩(wěn)定的可能。F2-6和F2-29遺傳穩(wěn)定性好，可用于后續(xù)研究。

表2 F2代改組菌株的遺傳穩(wěn)定性(±s，n＝3)Table 2 Results of genetic stability tests obtained for strains(± s，n ＝ 3)

表2 F2代改組菌株的遺傳穩(wěn)定性(±s，n＝3)Table 2 Results of genetic stability tests obtained for strains(± s，n ＝ 3)

菌株 L-鳥氨酸產(chǎn)量/(g/L)第一代 第二代 第三代 第四代 第五代 第六代F2-6 2.99±0.15 2.88±0.23 3.02±0.22 2.91±0.082.89±0.12 2.88±0.19 F2-21 2.94±0.05 2.79±0.07 1.86±0.11 1.68±0.131.77±0.03 1.65±0.21 F2-23 2.75±0.08 2.85±0.11 2.78±0.04 1.55±0.061.43±0.05 1.26±0.11 F2-29 2.74±0.12 2.55±0.05 2.78±0.11 2.86±0.212.78±0.07 2.67±0.15

2.6 原始菌ATCC 13032與改組菌株F2-6、F2-29搖瓶發(fā)酵比較

將原始菌ATCC 13032、改組菌F2-6、F2-29的種子液分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，測定搖瓶發(fā)酵72h過程中菌株生長及L-鳥氨酸生產(chǎn)情況。由圖4可知，發(fā)酵前期L-鳥氨酸的積累較慢，發(fā)酵24h后，3株菌株產(chǎn)酸速率加快，發(fā)酵72h時產(chǎn)酸量達到最高峰，且F2-6、F2-29，分別是其產(chǎn)量的13.6倍和12.5倍；改組菌F2-6與原始菌的生長曲線相似，均在發(fā)酵12h達到穩(wěn)定期，F(xiàn)2-29則于發(fā)酵24h達到穩(wěn)定期，其最終菌體濃度也大于前兩者，是原始菌的菌體濃度的115%。

圖4 原始菌ATCC 13032與改組菌F2-6、F2-29的搖瓶發(fā)酵曲線Fig.4 Growth curves and L-ornithine accumulation curves of strains ATCC 13032, F2-6 and F2-29 in shake-flask culture

3 討 論

谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因組序列的公布為探索L-鳥氨酸代謝機制提供了契機?；蚪M改組技術(shù)，不僅可快速改進細胞表型，而且還將在代謝工程及基因組學(xué)研究中發(fā)揮重要作用。本實驗以谷氨酸棒桿菌ATCC 13032為出發(fā)菌，通過兩輪基因組改組獲得2株性能穩(wěn)定的L-鳥氨酸高產(chǎn)菌，其中F2-6產(chǎn)量最高為2.99g/L，是出發(fā)菌株的13.6倍，為本課題組探索谷氨酸棒桿菌的L-鳥氨酸代謝機制及后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。目前，L-鳥氨酸代謝工程菌最高產(chǎn)量為3.295g/L[7](該生產(chǎn)菌株也是以ATCC 13032為出發(fā)菌，經(jīng)改造而得)。通過兩輪基因組改組獲得的F2-6產(chǎn)量與之接近。

進行基因組改組首先需要構(gòu)建一個候選菌庫，該菌庫中各正突變株的基因組之間差別越大，基因組改組后獲得表型有較大改進的雜交菌種的可能性就越大[18]。為擴大候選菌庫中菌株的遺傳背景的差異，采用3種高效誘變劑(NTG、UV、EMS)分別對谷氨酸棒桿菌ATCC 13032進行誘變。但如何高效篩選目的表型的突變株一直是誘變育種中的難點。擬選用合適的抗性標(biāo)記，以加快菌種篩選進程。據(jù)報道具有SG抗性的突變株，L-鳥氨酸產(chǎn)量會有較大提高[19]；具有NaF抗性的菌株，L-谷氨酸(合成L-鳥氨酸的前體)產(chǎn)量也有望增加。因此，選用SG和NaF為抗性篩選標(biāo)記。

研究過程中發(fā)現(xiàn)，采用常見的谷氨酸棒桿菌再生培養(yǎng)基[17]來再生ATCC 13032的原生質(zhì)體，結(jié)果僅獲得了16%的再生率，導(dǎo)致獲得高產(chǎn)量融合子的概率偏低。DMSO能保護細胞膜的穩(wěn)定性，增加細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；而鈣離子則能與細胞膜磷酯中一些負(fù)電荷相結(jié)合，增加細胞膜的穩(wěn)定性和完整性[20]。DMSO和CaCl2的添加可提高谷氨酸棒桿菌原生質(zhì)體的再生率，以保證高產(chǎn)改組菌能夠再生。

而對于融合子的篩選，先嘗試了將多親本的原生質(zhì)體融合后直接用含有SG及NaF的再生培養(yǎng)基再生，但培養(yǎng)一周后仍未發(fā)現(xiàn)有菌落長出。這可能是原生質(zhì)體再生和抗性標(biāo)記的雙重壓力抑制了菌株的生長。因此，本實驗采用將融合子的再生與抗性篩選分步操作。

總之，構(gòu)建遺傳背景差異較大的正突變菌庫，選用SG和NaF為雙抗性篩選標(biāo)記，提高原生質(zhì)體的再生率，采用多親本原生質(zhì)體滅活法，是本研究在短時間內(nèi)篩選出高產(chǎn)菌的關(guān)鍵。另外，谷氨酸棒桿菌是多種氨基酸的生產(chǎn)菌，本研究還將為其他氨基酸高產(chǎn)菌的選育及其代謝機制的探討提供借鑒。

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Genome Shuffling for Rapid Improvement ofL-Ornithine Production byCorynebacterium glutamicum

ZHANG Yuan-yuan1,2，LI Jia-zhou1
(1. Department of Food and Bioengineering, Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300, China；2. School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510300, China)

Genome shuffling was applied toCorynebacterium glutamicumATCC13032 to achieve rapid improvement ofL-ornithine production. Six mutant strains with subtle improvements inL-ornithine production were obtained by treatment with UV light, nitrosoguanidine or ethyl methane sulfonate and subjected to recursive protoplast fusion. The effects of medium components on the protoplast regeneration rate were investigated. High-yield strains were screened using plates containing different concentrations of sulfaguanidine and NaF. After two rounds of genome shuffling, two shuffled strains producingL-ornithine at high level with good genetic stability were selected and named as F2-6 and F2-29. After 72h of shake-flask fermentation, theL-ornithine yield of strain F2-6 reached 2.99 g/L, which was 13.6 times higher than that of the original strain.

genome shuffling；Corynebacterium glutamicum；L-ornithine；production

Q939.97

A

1002-6630(2012)15-0206-04

2011-08-22

國家自然科學(xué)基金面上項目(20876181)

張媛媛(1979—)，女，講師，博士研究生，研究方向為代謝工程。E-mail：merryyuan8044@sina.com