伍 季，尹紅娜*，竹 磊，呂 微

(1.河南省食品質(zhì)量安全控制工程技術研究中心，河南 鄭州 450002；2.河南省商業(yè)科學研究所有限責任公司，河南 鄭州 450002)

動物尿液中沙丁胺醇殘留快速檢測

伍 季1,2，尹紅娜2,*，竹 磊1，呂 微1

(1.河南省食品質(zhì)量安全控制工程技術研究中心，河南 鄭州 450002；2.河南省商業(yè)科學研究所有限責任公司，河南 鄭州 450002)

探索一種動物尿液樣品沙丁胺醇殘留的快速檢測方法。分別研究提取溶劑、β-環(huán)糊精與小分子醇的協(xié)同增敏作用和pH值對檢測結(jié)果的影響，對該方法的選擇性、線性方程、精密度和回收率以及檢出限進行考察。結(jié)果表明：最佳提取溶劑為異丁醇，β-環(huán)糊精濃度為5mmoL/L，添加4%(V/V)的乙醇之后，能夠明顯增加沙丁胺醇熒光強度，最佳pH9；該方法的精密度相對標準偏差、回收率以及檢出限分別為0.13%、96.57%、0.8μg/L。該動物尿液中沙丁胺醇殘留的熒光光度檢測方法，整個過程只需10～15min，操作方便，適合于現(xiàn)場檢測。

沙丁胺醇；殘留；動物尿液；熒光光度法；快速檢測

沙丁胺醇(salbutamol，SAL)屬于β2-興奮劑的一種，化學名稱為1-(4-羥基-3-羥甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇，是一種能與β2-腎上腺素能受體結(jié)合的藥物，臨床主要用于治療哮喘、支氣管痙攣等[1]。將SAL作為飼料添加劑使用，能顯著促進動物生長，增加飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率[2-3]，長期超量使用，則會在動物組織中蓄積，人過量使用這種動物產(chǎn)品后會引發(fā)中毒。

隨著對“瘦肉精”的監(jiān)察和檢測力度的增大，一些非法使用者開始轉(zhuǎn)向其他替代品。由于沙丁胺醇的結(jié)構(gòu)與“瘦肉精”相似，所以其具有相似的作用[4]；又因為SAL在動物體內(nèi)消除的時間較短、毒性較弱，因此SAL就成為“瘦肉精”最主要的替代品[5]。藥物在動物體內(nèi)，隨著尿液生成過程中的濃縮，尿藥濃度逐漸升高，大多遠遠高出血藥濃度，因此易于測定[6]；其次，尿液也可無損傷收集，這也是在檢測藥物濃度時通常選尿液為檢測標本的原因；此外，檢測動物尿液中的藥物含量，適用于動物的宰前控制，可有效地預防藥物殘留超標的動物性食品流入市場，對保障動物性食品的安全具有重大意義。

目前，國內(nèi)外對SAL檢測方法的研究還處于起步階段，國內(nèi)還沒有關于動物體內(nèi)SAL殘留檢測統(tǒng)一的國家標準?，F(xiàn)行的檢測方法也很多，有沙丁胺醇的檢測方法主要有高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(high-performance liquid chromatography-mass spectrometer，HPLC-MS)[7-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)[10-12]、高效液相色譜法(HPLC)[13-16]和酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[17-18]等。但這些方法從抗干擾、定量的準確程度以及檢測時間方面都存在一定的問題[19]。

本實驗旨在對以豬尿為代表的動物尿液前處理手段進行研究，建立一種快速、準確的熒光光度檢測方法，此方法具有靈敏度高(檢出限為10-4～10-6g/L)，選擇性強、用樣量少、操作簡便等優(yōu)點[20]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

動物尿液(豬尿) 鄭州市屠宰廠。

沙丁胺醇標準品 中國食品藥品檢定研究院；所用試劑均為分析純；實驗用水為亞沸蒸餾水。

AnkeTGL-16c離心機 上海安亭科學儀器廠；F-850型熒光光度計 日本日立公司；PHS-2C型精密酸度計上海大普儀器有限公司；AL204-IC型分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 方法

因為尿液中所含的干擾成分含量較小，所以在以尿液為檢測標本時，大都直接進行檢測，不需再做其他處理。本項目中對尿液樣品檢測時，發(fā)現(xiàn)尿液樣品一般為黃色，影響檢測，所以需對尿液提取后進行檢測。

在Ex/Em波長為280nm/310nm的條件下檢測所涉及的各種溶劑、提取液。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

由于SAL的Ex/Em波長為280nm/310nm[21]，為了避免干擾，所選溶劑在280nm/310nm處的熒光強度值要小。依據(jù)資料選擇幾種對SAL溶解性較好的溶劑進行選擇——異丁醇、正丁醇、異丙醇、乙酸乙酯、丙酮、異丁醇＋乙酸乙酯、異丙醇＋乙酸乙酯，對其做熒光波譜掃描，從抗干擾情況來看，較為合適的溶劑為乙酸乙酯、異丁醇和正丁醇。

除了抗干擾因素，最佳提取溶劑還將由其提取率確定。根據(jù)以上結(jié)果，取3份10mL 5mg/L SAL溶液，分別加入等體積的乙酸乙酯、正丁醇和異丁醇溶劑萃取，分離出有機層，干燥后在280nm/310nm測其熒光強度值(I)，分別與空白溶劑的熒光強度值比較，差值越大則證明其提取率越高，結(jié)果見表1。

從表1可看出，異丁醇的提取率較高，說明異丁醇對SAL的熒光強度值影響最小，所以最終確定異丁醇作為提取溶劑。

表1 最佳提取溶劑的選擇Table 1 Screening of optimal solvent for SAL extraction

2.2β-環(huán)糊精(β-CD)與小分子醇的協(xié)同增敏作用

尿液組成比較復雜，用異丁醇直接提取后效果不理想，可能是由于尿液中有其他物質(zhì)導致SAL熒光猝滅。本實驗采用β-CD來屏蔽一部分干擾。β-CD具有一個高為0.79nm、直徑為0.60～0.65nm的筒狀空腔，這種特殊的分子結(jié)構(gòu)賦予β-CD與其極性相似、分子大小與其空腔相匹配的不同類型的分子均能形成包絡物的特性。

尿液經(jīng)異丁醇提取后，分出上層有機層，加入1mLβ-CD，利用其空腔屏蔽掉一些能夠?qū)е聼晒忖绲囊蛩?，取得了一定的效果。實驗研究了?CD在濃度為1～10mmol/L范圍內(nèi)的效果。結(jié)果表明，在選定β-CD濃度為5mmol/L時，β-CD的效果最好(圖1)。

圖1 β-CD濃度與熒光強度的關系Fig.1 Effect of β-CD concentration on fluorescence intensity

同時，對甲醇、乙醇、正丁醇、異丁醇與β-CD協(xié)同增敏作用進行研究發(fā)現(xiàn)，在添加了4%(V/V)的乙醇溶液之后，能夠明顯增加SAL熒光強度(圖2)。

圖2 小分子醇對β-CD的增敏效果Fig.2 Enhancing effect of alcohols on β-CD efficacy for resisting interferences

2.3 pH值對測定結(jié)果的影響

實驗過程中發(fā)現(xiàn)pH值在實驗中起著非常重要的影響，影響到異丁醇提取效果。實驗討論了pH值為2～11的異丁醇提取沙丁胺醇的回收率，結(jié)果表明，在pH9的時候，異丁醇有最佳提取率。

圖3 pH值對熒光強度和回收率的影響Fig.3 Effect of pH on recovery rate and fluorescence intensity

2.4 本方法選擇性考察

取7份空白尿液，按照樣品前處理方法處理后，在選定的激發(fā)光和發(fā)射光波長下測定其熒光值分別為1.871、1.871、1.870、1.871、1.870、1.871、1.871。此外，表1中異丁醇空白溶劑在Ex/Em波長為280nm/310nm時的吸收值為1.831，證明在所選定的實驗條件下，經(jīng)處理尿液中的物質(zhì)不影響實驗的測定。

2.5 本方法的線性范圍考察

分別配制10mL 0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0mg/L的SAL溶液，加入1mL 5mmol/L的β-環(huán)糊精和4%(V/V)的乙醇后，在Ex/Em為280nm/310nm處測其熒光強度值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0～20.0mg/L之間質(zhì)量濃度與熒光強度值呈線性關系。線性方程為y＝1.1971x＋1.8655，相關系數(shù)為0.9999。

圖4 SAL質(zhì)量濃度與熒光強度的線性關系Fig.4 Linear relationship between SAL concentration and fluorescence intensity

2.6 精密度和回收率

取21份尿樣，分為3組，向每份樣品中分別添加沙丁胺醇儲備液，使添加量為0.05、1.0、10.0mg/L，經(jīng)前處理步驟處理后，調(diào)整pH9，加入5mmol/Lβ-CD 1mL和4%(V/V)的乙醇，測其熒光強度值，計算相對標準偏差(relative sandard deviation，RSD)和平均回收率，結(jié)果見表2。

表2 尿液精密度和回收率實驗結(jié)果Table 2 Recovery rates and precision for the determination of SAL in urine

2.7 檢出限

測定20次尿樣空白，求得標準偏差(Sb)為0.000308，依據(jù)國際純粹與應用化學協(xié)會(International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC)的建議，計算檢出限CL＝KSb/m。式中：CL為檢出限；Sb為空白多次測得信號的標準偏差；K為根據(jù)一定置信水平確定的系數(shù)；m為分析標準曲線在低濃度范圍內(nèi)的斜率。測定20次空白，系數(shù)K＝3、m＝1.19711，因此此方法的檢出限為0.8μg/L。

3 結(jié) 論

本實驗得出尿液最佳處理方法是取10mL尿樣，用0.01mol/L NaOH溶液將其pH值調(diào)至9，用60mL異丁醇提取，加入1mL 5mmol/Lβ-環(huán)糊精和4%(V/V)的乙醇后，濃縮至10mL，在Ex/Em為280nm/310nm處檢測其熒光強度值。

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Rapid Detection of Salbutamol Residue in Animal Urine

WU Ji1,2，YIN Hong-na2,*，ZHU Lei1，LWei1
(1. Henan Food Quality and Safety Control Engineering Research Center, Zhengzhou 450002, China；2. Henan Commerce Science Institute Co. Ltd., Zhengzhou 450002, China)

In order to explore a rapid method for the determination of salbutamol (SAL) residues in animal urine, the impacts of extraction solvent,β-CD concentration for synergistic sensitization with small alcohol molecules and pH on determination results were explored. The optimal extraction solvent was isobutanol, aβ-CD concentration of 5 mmol/L was found optimal,and under these conditions, the fluorescence intensity of SAL was enhanced remarkably by adding 4% ethanol. The optimal pH was 9. The precision (RSD), recovery rate and detection limit of this method were 0.013%, 96.57% and 0.8 μg/L, respectively.The whole course of SAL determination by this method could be completed within 10－15 min. This method was simple, efficient,and suitable for thein situdetermination of SAL residue.

salbutamol (SAL)；residue；animal urine；fluorescence method；rapid detection

O657.3；TS207.3

A

1002-6630(2012)16-0208-04

2011-07-15

河南省預研項目(0641190102)

伍季(1956—)，男，高級工程師，本科，主要從事食品安全研究。E-mail：zzwuji@sina.com

*通信作者：尹紅娜(1979—)，女，工程師，碩士，主要從事食品質(zhì)量安全檢測研究。E-mail：nana0705@163.com