麻成金，黃 偉，黃 群，吳竹青，吳麗雅

(1.吉首大學 林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000；2.吉首大學食品科學研究所，湖南 吉首 416000)

響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取仿栗籽油工藝及其脂肪酸組成分析

麻成金1,2，黃 偉2，黃 群2，吳竹青2，吳麗雅2

(1.吉首大學 林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000；2.吉首大學食品科學研究所，湖南 吉首 416000)

采用超聲波輔助提取仿栗籽油，通過單因素試驗和響應面法(RSM)對提取工藝進行優(yōu)化，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定仿栗籽油的脂肪酸組成。結(jié)果表明，超聲波輔助提取仿栗籽油的優(yōu)化工藝條件為以環(huán)己烷為提取溶劑、超聲工作/間歇時間為3s/1s、超聲功率540W、超聲時間18min、提取溫度60℃、液料比8.6:1(g/mL)，在此工藝條件下，仿栗籽油提取率可達94.53%。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定結(jié)果表明仿栗籽油中富含不飽和脂肪酸，總含量達到70.13%，其中油酸和亞油酸的含量分別為53.95%、16.18%。

仿栗籽油；超聲波輔助提??；響應面分析；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析；脂肪酸組成

仿栗(Sloanea hemsleyana(Ito) Rehd. et Wils)系杜英科猴歡喜屬常綠喬木，在我國湖南、湖北、四川、云南、貴州及廣西等省有廣泛分布，其中以湖南西部分布最多[1]。仿栗產(chǎn)果量高，成年仿栗樹每株可年產(chǎn)種籽15～20kg，仿栗籽含油率在49%～58%，可以用于制備高檔食用油與生物柴油原料油，開發(fā)利用價值較高[2-3]。超聲輔助提取技術是近年興起來的一種油脂提取分離新技術，具有簡便快捷、安全高效、易于實現(xiàn)工業(yè)化等優(yōu)點[4-5]。響應面法(response surfacemethodology，RSM)是解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法，利用合理的試驗設計，采用多元二次回歸方程來擬合響應值與因素之間的函數(shù)關系，然后通過對回歸方程的分析來尋求最佳工藝參數(shù)，以較少試驗次數(shù)和較短時間對所選的試驗參數(shù)進行全面研究，在生物化工過程優(yōu)化中有著廣泛應用[6-7]。

目前，國內(nèi)外對仿栗籽油研究報道較少，國內(nèi)有人對壓榨法、超臨界流體法和超聲波輔助法提取仿栗籽油進行了研究，胡欣欣等[3]通過正交試驗設計對超聲波輔助溶劑法提取仿栗籽油進行了研究，但其未考察超聲波功率、超聲工作時間/間歇時間等因素對仿栗籽油提取效果的影響。本試驗探索仿栗籽油提取工藝，通過響應面法優(yōu)化工藝參數(shù)，以求獲得更高效的仿栗籽油提取技術參數(shù)，并對仿栗籽油的脂肪酸組成進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，了解仿栗籽油的主要脂肪酸種類和含量，為開發(fā)仿栗籽資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

仿栗果實于2011年10月初采摘，風干取出種籽并分離種衣，干燥后粉碎過60目篩，密封保存供試驗用，經(jīng)測定粗脂肪含量為50.17%。

乙酸乙酯、丙酮、石油醚(沸程60～90℃)、環(huán)己烷、硫酸等為國產(chǎn)分析純；甲醇、正己烷為色譜純。

1.2 儀器與設備

JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；CDE-220E2多功能食品處理機 佛山市順德區(qū)歐科電器有限公司；HH.S精密恒溫水浴鍋 江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；GZX-9146MBE電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；JA2003電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

仿栗籽→干燥→粉碎→過篩→超聲波處理→抽濾分離→減壓蒸餾→溶劑回收→干燥→仿栗籽油

1.3.2 仿栗籽油提取率計算

仿栗籽油脂含量測定采用索氏提取法，參考GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》，計算仿栗籽油提取率。

1.3.3 單因素試驗

每次試驗稱取仿栗籽粉末10g，分別對提取溶劑(乙酸乙酯、石油醚(沸程60～90℃)、環(huán)己烷、丙酮)，超聲工作/間歇時間(s)(5/1、4/1、3/1、2/1、1/1、1/2)，超聲功率(300、350、400、450、500、550、600W)，超聲時間(5、10、15、20、25、30min)，提取溫度(20、30、40、50、60、70℃)，液料比(3:1、5:1、7:1、9:1、11:1、13:1)進行單因素試驗，考察各因素對油脂提取率的影響[7]。

1.3.4 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，選取超聲功率、超聲時間、提取溫度、液料比作為考察變量，采用四因素三水平的響應面分析法，以提取率為響應值，對超聲波輔助提取仿栗籽油工藝條件進行優(yōu)化[9-11]。

1.3.5 仿栗籽油的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

1.3.5.1 仿栗籽油甲酯化

稱取所得仿栗籽油1mL置于圓底燒瓶，加入0.5mol/L的KOH-甲醇溶液10mL于70℃水浴加熱60min，冷卻后轉(zhuǎn)入分液漏斗，加入20mL正己烷，搖均勻后靜置分層，取出上清液，用蒸餾水洗滌2～3次，加入無水硫酸鎂干燥脫水，最后4500r/min離心10min，取上層清液置于瓶中待測[5,8]。

1.3.5.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀工作條件

氣相色譜條件：Agilent 190191S-433型石英毛細管柱(325℃，30m×250μm，0.25μm)；載氣為高純氦氣(99.999%)，柱前壓69.8kPa，柱內(nèi)載氣流量2mL/min；100℃開始保持2min，以15℃/min升溫到160℃，再以5℃/min升溫到250℃保持5min；氣化室溫度300℃；樣品進樣量1μL；分流比50:1。

質(zhì)譜條件：EI離子源溫度230℃，溶劑延時4min，電子能量70eV，掃描范圍30～500u，分辨率1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溶劑的確定

本試驗通過比較乙酸乙酯、丙酮、石油醚(沸程60～90℃)和環(huán)己烷4種溶劑對仿栗籽油提取率的影響來確定較佳提取溶劑。提取條件：超聲工作/間歇時間2s/1s、超聲功率450W、超聲時間15min、提取溫度50℃、液料比7:1，結(jié)果見圖1。由圖1可知，環(huán)己烷的提取效果最好，故選用環(huán)己烷作為超聲波輔助提取仿栗籽油的提取溶劑。

圖1 不同溶液劑對油脂提取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvents on oil yield

2.1.2 超聲工作/間歇時間的確定

以環(huán)己烷為提取溶劑，在超聲功率450W、超聲時間15min、提取溫度50℃、液料比7:1的條件下，考察不同超聲工作/間歇時間對提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，隨著超聲工作/間歇時間增加，提取率逐漸增大，到3s/1s后趨于平緩，這可能是由于超聲波作用時間與超聲次數(shù)拮抗作用的結(jié)果。故選擇超聲工作/間歇時間為3s/1s進行后續(xù)試驗。

2.1.3 超聲功率對油提取率的影響

超聲時間15min、提取溫度50℃、液料比7:1，不同超聲功率對油提取率的影響如圖3所示。

由圖3可知，仿栗籽油提取率隨超聲功率增加逐漸增大，在500W時達最大，隨后略有下降。這可能是因為對于一定的頻率和發(fā)射面，超聲功率過大，聲壓幅值過大，以至空化泡在聲波壓縮相內(nèi)來不及發(fā)生崩潰，而影響空化效果[11]，故選取超聲功率500W較適宜。

2.1.4 超聲時間對油提取率的影響

超聲功率450W、提取溫度50℃、液料比7:1，不同超聲時間對油脂提取率的影響如圖4所示。由圖4可知，提取率隨超聲時間的延長而增大，但提取時間超過15min后增長緩慢，因此提取時間選擇15min為宜。

圖4 超聲時間對油脂提取率的影響Fig.4 Effect of total ultrasonic treatment time on oil yield

2.1.5 提取溫度對油脂提取率的影響

超聲功率450W、超聲時間15min、液料比7:1，不同提取溫度對油提取率的影響如圖5所示。

圖5 提取溫度對油脂提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on oil yield

由圖5可知，仿栗籽油提取率隨著溫度升高而增大，當溫度達到6 0℃時，提取率最高，而后開始下降。這可能是因為溫度過高，溶劑的揮發(fā)加快，減少了溶劑和仿栗籽粉之間的有效接觸面，浸出過程難以穩(wěn)定，從而造成提取率下降[12-13]，因此選擇60℃為提取溫度。

2.1.6 液料比對油提取率的影響

超聲功率450W、提取溫度50℃、超聲時間15min，不同液料比對油提取率的影響如圖6所示。

圖6 液料比對油提取率的影響Fig.6 Effect of solid-to-liquid ratio on oil yield

由圖6可知，仿栗籽油提取率隨液料比的增加呈先增加后減少的趨勢，在液料比為7:1(mL/g)時，提取率達到最大值。這是因為當原料量一定時，溶劑用量越大，體系滲透壓越大，油脂越容易被提取出來，但如果液料比過大，會增加超聲波破碎細胞的阻力，使細胞破碎程度下降，從而降低油脂的提取率[14-15]，故7:1(mL/g)為適宜的液料比。

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 模型的建立與顯著性檢驗

根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，依據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，選取超聲功率(X1)、超聲時間(X2)、提取溫度(X3)和液料比(X4)4個因素，以仿栗籽油提取率(Y)為響應值，設計四因素三水平的Box-Behnken試驗。試驗因素水平見表1，試驗設計方案及結(jié)果見表2。

表1 超聲波輔助提取仿栗籽油工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

表2 超聲波輔助提取仿栗籽油工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗設計方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and corresponding experimental results

通過SAS軟件對表2中試驗結(jié)果進行回歸擬合分析，經(jīng)二次回歸擬合后求得的回歸方程為：

方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis for the fitted regression model

從表4可知，回歸決定系數(shù)R2＝0.9696，說明響應值的變化有96.96%來源于所選因素的變化，模型修正決定系數(shù)R2Adj＝0.9341，說明該模型能解釋93.41%響應值的變化，回歸方程的顯著性檢驗極顯著、失擬性檢驗不顯著，說明回歸方程的預測值與試驗值非常吻合，故該模型可用于仿栗籽油超聲波輔助提取試驗的理論預測。從方差分析表中各因素的F值可以看出，各因素對油脂提取率影響大小順序為液料比＞超聲功率＞超聲時間＞提取溫度，且液料比、超聲功率和超聲時間對提取率影響達到了極顯著水平?？疾煲蛩亻g交互作用，由表3可知，超聲時間與液料比、提取溫度的交互作用達到了極顯著水平，與超聲功率的交互作用達到了顯著水平。

2.2.2 響應面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸方程，利用SAS 8.1軟件作出交互作用顯著雙因素的曲面圖和等高線圖見圖7，可以直觀地預測響應值以及確定變量相互作用的關系[16]。由圖7a可知，超聲功率與超聲時間交互作用顯著，在超聲功率一定時，提取率隨超聲時間的延長而先增加后減小，在超聲功率較大時，隨著超聲時間的延長，提取率增加幅度較大，但超聲功率過大、時間過長時，提取率反而降低，這可能是因為長時間的大功率超聲導致脂肪分解而影響了提取率。由圖7b可知，提取溫度與超聲時間交互作用極顯著，提取溫度較低時，提取率隨著超聲時間的延長，上升幅度較大，溫度較高時，油提取率變化平緩，且長時間高溫作用時，油脂提取率明顯降低，這可能是因為高溫導致提取溶劑揮發(fā)和油脂分解的結(jié)果。由圖7c可知，液料比與超聲時間交互作用極顯著，當液料比較大時，較短的超聲時間即可達到較高油提取率，增加幅度較大，這是因為液料比大、體系滲透壓大，油脂溶出更快，故可在短時間內(nèi)達到較好的提取效果。

為了精確計算最佳工藝參數(shù)，對回歸方程式中4個自變量分別求偏導并使其等于0，解方程可得優(yōu)化工藝參數(shù)：超聲功率538.68W、超聲時間18.08min、提取溫度59.77℃、液料比8.57:1(mL/g)，在此優(yōu)化工藝條件下，仿栗籽油的理論提取率可達95.48%。

圖7 各兩因素交互作用對仿栗籽油提取率影響的響應面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the interactive effects of four extraction parameters on oil yield

2.2.3 最佳工藝確定與驗證實驗

為檢驗響應面法優(yōu)化仿栗籽油提取工藝的可靠性，對優(yōu)化提取工藝條件進行驗證實驗，結(jié)果取3次平行試驗的平均值?？紤]到實際操作便利性，將優(yōu)化工藝參數(shù)調(diào)整為：超聲功率540W、超聲時間18min、提取溫度60℃、液料比8.6:1(mL/g)，在此工藝條件下，仿栗籽油提取率為94.53%，與理論預測值僅相差0.95%，說明運用響應面法優(yōu)化得到的模型工藝參數(shù)準確可靠，應用價值較高。

2.3 仿栗籽油的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析結(jié)果

對上述試驗所得仿栗籽油經(jīng)甲酯化處理后進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，測定脂肪酸組成，利用NIST 05標準譜庫進行檢索，并逐個解析各峰相應的質(zhì)譜圖，采用不做校正的峰面積歸一法確定各組分的相對含量。仿栗籽油的脂肪酸甲酯氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析總離子流色譜圖見圖8，分析結(jié)果見表4。

圖8 仿栗籽油脂肪酸甲酯總離子流色譜圖Fig.8 Total ion current chromatogram of fatty acids in Sloanea hemsleyana seed oil

表4 仿栗籽油脂肪酸的組成及相對含量Table 4 Fatty acids and relative contents in Sloanea hemsleyana seed oil

由表4可知，仿栗籽油中主要含有肉豆寇酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸5種脂肪酸，不飽和脂肪酸相對含量達70.13%，其中油酸和亞油酸相對含量分別為53.95%和16.18%。

3 結(jié) 論

采用響應面分析法優(yōu)化了超聲波輔助提取仿栗籽油工藝條件，建立了相應的數(shù)學模型，模型回歸極顯著，對試驗擬合較好；得到了優(yōu)化提取工藝條件：以環(huán)己烷為提取溶劑、超聲工作/間歇時間3s/1s、超聲功率540W、超聲時間18min、提取溫度60℃、液料比8.6:1(mL/g)，在此工藝條件下，仿栗籽油提取率可達94.53%，與數(shù)學模型的理論預測值基本一致。并對仿栗籽油的脂肪酸組成進行氣質(zhì)聯(lián)用分析，結(jié)果表明仿栗籽油中主要含有肉豆寇酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸5種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸含量為70.13%，以油酸、亞油酸為主，具有較高的開發(fā)利用價值。

[1] 李昌珠, 張良波, 向祖恒, 等. 仿栗生物學特性及果實油脂含量分析[J]. 湖南林業(yè)科技, 2008, 35(2): 5-7.

[2] 麻成金, 吳竹青, 傅偉昌, 等. 響應面法優(yōu)化仿栗籽油超臨界萃取工藝[J]. 食品科學, 2010, 31(18): 196-202.

[3] 胡欣欣, 麻成金, 黃群, 等. 超聲波輔助萃取仿栗籽油的研究[J]. 江蘇食品與發(fā)酵, 2008(1): 11-14.

[4] ATHANASIOS C, NIKOLAS G S, DIMITR J D, et al. Comparison of distillation and ultrasound-assisted extraction methods for the isolation of compounds from garlic (Allium sativum)[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2006, 13(1): 54-60.

[5] 麻成金, 吳竹, 黃偉, 等. 側(cè)柏籽油的超聲輔助提取及其脂肪酸組成分析[J]. 食品科學, 2010, 31(24): 50-55.

[6] LI Quanhong, FU Caili. Application of response surface methodology for extraction optimization of germinant pumpkin seeds protein[J]. Food Chemistry, 2005, 92(4): 701-706.

[7] 單成俊, 周劍忠, 黃開紅, 等. 超聲波輔助提取黑莓籽油及其脂肪酸組成分析[J]. 中國糧油學報, 2010, 25(5): 62-64.

[8] 鄧紅, 孫俊, 張媛, 等. 不同方法提取文冠果籽油的GC-MS分析[J].食品科學, 2007, 28(8): 354-357.

[9] 張峰, 仇農(nóng)學. 響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取辣椒籽油及脂肪酸組成分析[J]. 中國油脂, 2010, 33(11): 38-43.

[10] 王敬敬, 麻成金, 曾巧輝, 等. 響應面優(yōu)化超聲波輔助水酶法提取茶葉籽油工藝[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2010, 16(10): 53-57.

[11] 陳芹芹, 李淑燕, 楊陽, 等. 響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取蘋果籽油的工藝研究[J]. 中國糧油學報, 2010, 25(5): 52-55.

[12] LI Haizhou, PORDESINO L, WEISS J. High intensity ultrasoundassisted extraction of oil from soybeans[J]. Food Research International,2004, 37(7): 731-738.

[13] 仇農(nóng)學, 高霞. 蘋果籽油的超聲波輔助提取及理化性質(zhì)分析[J]. 食品科學, 2007, 28(11): 50-55.

[14] ZHANG Ying, WANG Zhenyu, CHEN Xiaoqiang. Ultrasound associated extraction of seed oil of Korean pine[J]. Journal of Forestry Research,2005, 16(2): 140-142.

[15] 劉雪梅, 王超, 喬旭光, 等. 蘋果籽油的超聲波輔助提取及成分分析[J]. 中國油脂, 2009, 34(6): 16-19.

[16] TANYILDIZI M S, O..ZER D, ELIBOL M. Optimization ofα-amylase production by Bacillus sp. using response surface methodology[J]. Process Biochemistry, 2005, 40(7): 2291-2296.

Response Surface Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction and Fatty Acid Composition Analysis ofSloanea hemsleyanaSeed Oil

MA Cheng-jin1,2，HUANG Wei2，HUANG Qun2，WU Zhu-qing2，WU Li-ya2
(1. Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering, Jishou University, Zhangjiajie 427000, China；2. Institute of Food Science, Jishou University, Jishou 416000, China)

Response surface methodology (RSM) was employed to optimize the ultrasound-assisted extraction of essential oil fromSloanea hemsleyanaseeds. Meanwhile, the chemical composition of the extracted essential oil was analyzed by GC-MS.The results showed that the optimal extraction conditions were cyclohexane as the best extraction solvent, single ultrasonic treatment for 3 s at a power level of 540 W followed by a 1-s interval, 18 min of total extraction time, and 1:8.6 of solid-to-liquid ratio, resulting in an oil yield of 94.53%. The essential oil obtained under these conditions was abundant in unsaturated fatty acids with a total content of 70.13%. The contents of oleic acid and linoleic acid were 53.95% and 16.18%, respectively.

Sloanea hemsleyanaseed oil；ultrasonic-assisted extraction；response surface analysis；GC-MS；fatty acid composition

TS224.4

A

1002-6630(2012)16-0024-06

2012-04-10

湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金項目(09K089)；林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室開放項目(JDZ201101)

麻成金(1963—)，男，教授，碩士，研究方向為食物資源開發(fā)與利用。E-mail：machengjin368@126.com