劉寧 宋磊 陳文芳 劉紅軍

重組大腸桿菌高密度生產(chǎn)G-CSF發(fā)酵工藝優(yōu)化

劉寧 宋磊 陳文芳 劉紅軍

目的優(yōu)化重組人粒細胞集落刺激因子，以獲得工程菌的高密度發(fā)酵和目的蛋白的高表達。方法 借助正交實驗，在14L發(fā)酵罐中，研究重組人粒細胞集落刺激因子工程菌在添加不同濃度鉀鹽、鈉鹽和鎂鹽后對質(zhì)粒穩(wěn)定性和目的蛋白表達的影響。結(jié)果在高濃度鹽的環(huán)境下，菌株的比生長速率和質(zhì)粒穩(wěn)定性均顯著提高，從而提高目的蛋白的表達量。結(jié)論獲得一種高效生產(chǎn)人粒細胞集落刺激因子的方法。

粒細胞集落刺激因子;高鹽效應(yīng);高密度發(fā)酵;質(zhì)粒穩(wěn)定性

1 材料

1.1 菌株 重組大腸桿菌GCSF/pET23a/BL21(DE3)由本實驗室保存。

1.2 試劑 胰蛋白胨、酵母浸出粉為Oxoid公司產(chǎn)品，IPTG、氨芐青霉素(AMP)為Sigma公司產(chǎn)品，其余均為國藥集團分析純試劑。

1.3 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，NaCl 5 g/L)、LB固體培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基+20 g瓊脂/L)、發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基((NH4)2HPO44 g/L，酵母浸出粉 1 g/L，KH2PO414 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，葡萄糖 2 g/L，微量元素10 ml/L，氨水和稀硫酸調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2)。微量元素儲備液(FeSO4·7H2O 1 g/L，MnSO4·H2O 1 g/L，ZnSO4·7H2O 2.78 g/L，CoCl2·6H2O 2 g/L，Na2MO4·2H2O 2 g/L，CuSO45H2O1.85 g/L，H3BO30.5 g/L)。發(fā)酵補料培養(yǎng)基1(葡萄糖600 g/L)，發(fā)酵補料培養(yǎng)基2(酵母浸出粉100 g/L，Mg-SO4·7H2O 200 g/L，KCL 150 g/L，NaCL 150 g/L)。培養(yǎng)基中AMP的工作濃度為100 mg/L。

1.4 儀器與設(shè)備 美國NBS 14 L發(fā)酵罐，天津醫(yī)療二廠WM-2H無油空壓機，日立連續(xù)流離心機，尤尼柯紫外可見分光光度計，Bio-Rad蛋白質(zhì)電泳儀和凝膠成像分析系統(tǒng)。

2 方法

2.1 種子培養(yǎng) 種子的活化和培養(yǎng)為:將-70℃甘油凍存菌轉(zhuǎn)接于5 ml LB液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)，OD600為0.6～1.0時按1∶100轉(zhuǎn)接于25 ml LB液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，OD600為0.6左右，轉(zhuǎn)接于800 ml LB，37℃，搖床培養(yǎng)過夜。

2.2 發(fā)酵工藝 800 ml種子液接種于8L基礎(chǔ)培養(yǎng)中，發(fā)酵過程中使用氨水和稀硫酸控制pH為7.0，溫度37℃，轉(zhuǎn)速由初始220rpm最高升至800rpm以維持溶解氧濃度(DO)，必要時通純氧以保證DO高于30%。當(dāng)DO值突然升高的時候開始流加補料培養(yǎng)基，補料培養(yǎng)基1流加與補料培養(yǎng)基2體積比為1.5∶1，補料流加分為三個階段:DO-stat流加階段、指數(shù)流加補料階段、勻速流加補料階段。當(dāng)OD600達到40～50，用1 mm異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進行誘導(dǎo)，發(fā)酵時間為18～20 h。

2.3 正交試驗研究不同金屬鹽濃度對質(zhì)粒穩(wěn)定性和G-CSF產(chǎn)量的影響 設(shè)計鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽三因素60 mm、120 mm、180 mm、240 mm四水平的正交試驗(表1)。通過流加補料培養(yǎng)基，使培養(yǎng)集中的金屬鹽濃度分別達到表1中所示。

表1 正交試驗因素、水平設(shè)計表

2.4 比生長速率與金屬鹽濃度對質(zhì)粒穩(wěn)定性和G-CSF產(chǎn)量的影響 批次1與2均在普通鹽濃度下生長表達，批次1在表達階段平均比生長速率約為0.03 L/h，批次二約為0.07 L/h。批次3與4都在高鉀鹽鎂鹽條件下，批次3在表達階段平均比生長速率約為0.03 L/h，批次4約為0.07 L/h。

2.5 質(zhì)粒穩(wěn)定性的檢測 使用平行平板法測定［7］。

2.6 G-CSF產(chǎn)量的測定 發(fā)酵液離心洗滌后收集菌體，用細胞超聲粉碎機粉碎，離心取得包涵體沉淀。加上樣緩沖液煮沸溶菌，進行15%SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，掃描測定G-CSF表達量。

3 結(jié)果

3.1 各因素水平對質(zhì)粒穩(wěn)定性和G-CSF產(chǎn)量的影響 通過對表2的分析得出以下結(jié)論:對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響:A鉀鹽濃度＞C鎂鹽濃度＞B鈉鹽濃度，對G-CSF產(chǎn)量的影響:C鎂鹽濃度＞A鉀鹽濃度＞B鈉鹽濃度。通過實驗數(shù)據(jù)我們可以發(fā)現(xiàn)，鉀鈉鎂離子對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性上面都起著重要作用，其中鉀鎂離子的作用隨濃度升高效果明顯逐漸增強，而鈉離子在低濃度時，就起到一定作用。鉀鎂離子對提高G-CSF產(chǎn)量有著顯著作用，而鎂離子作用最高。根據(jù)主要因素取最高水平，次要因素則根據(jù)節(jié)約方便的原則，選出C鎂鹽濃度240 mm，鉀鹽濃度在180～240 mm之間，鈉鹽濃度60 mm。3.2 在高濃度鉀鹽和鎂鹽下比生長速率對質(zhì)粒穩(wěn)定性和GCSF產(chǎn)量的影響

從圖1結(jié)果可知在普通鹽濃度下，低的比生長速率不僅獲得高質(zhì)粒穩(wěn)定性(55%)，且得到較高的G-CSF產(chǎn)量(1.6 g/L)。在普通鹽濃度下，高比生長速率因大幅下降質(zhì)粒的穩(wěn)定性(35%)，而使得產(chǎn)量也降低到1.2 g/L，不利于生產(chǎn)。而在200 mm鉀鹽和240 mm鎂鹽的高鹽條件下，雖然表達階段高比生長速率使質(zhì)粒的穩(wěn)定性由97%降至78%，但是G-CSF的產(chǎn)量卻由3.5 g/L提高至4.1 g/L。高濃度金屬鹽、高比生長速率的培養(yǎng)條件比普通濃度金屬鹽、低比生長速率的工藝，GCSF產(chǎn)量提高了156%。

表2 試驗設(shè)計、結(jié)果及分析

圖1 在高濃度鉀鹽和鎂鹽下比生長速率對質(zhì)粒穩(wěn)定性和G-CSF產(chǎn)量的影響

4 小結(jié)

基因工程產(chǎn)品在醫(yī)藥、保健、食品、環(huán)保等方面逐漸表現(xiàn)出其極大的潛在能力和市場占有率，高密度發(fā)酵在保證產(chǎn)品質(zhì)量的前提下可以提高產(chǎn)量，降低成品，隨著高密度技術(shù)的發(fā)展，如何保證含目的基因質(zhì)粒的穩(wěn)定性逐漸被人們重視。培養(yǎng)條件及質(zhì)粒中所攜帶的外源基因性質(zhì)、重組菌的生長速率、外源基因的表達水平等因素都會影響質(zhì)粒穩(wěn)定性［8-10］。本研究圍繞改變重組菌的生長環(huán)境方面展開，借助正交實驗方法選擇出含終濃度240 mm/L鎂離子200 mm/L鉀離子高濃度金屬鹽的組成培養(yǎng)基，獲得一條在高比生長速率下同樣可以明顯提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的發(fā)酵工藝，最終使得G-CSF的產(chǎn)量提高了156%，是一條適合工業(yè)化的低成本高產(chǎn)出發(fā)酵方案。

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The optimiztion of high cell-density culture of G-CSF us recombinamt Escherichia coli

LIU Ning，SONG

Lei，CHEN Fan，et al．Quangang Laboratories Companylimited in Shandong Province，Jinan 250014，China

Objective To optimize the fermentation procedure of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor and to obtain high cell density and high level expression of the aim protein.Methods With orthogonal experiment，study the influence of different concentration potassium，sodium salt and magnesium salt on plasmid stability and expression of aim protein in a 14L fermentor.Results Under high concentrations of salt in the culture，the specific growth rate of strains and plasmid stability were significantly improved，so as to improve the purpose of protein expression.Conclusion Gain a efficient fermentation method to produce recombinant human granulocyte colony-stimulating factor.

G-CSF;High salt-induced;High cell-density culture;Plasmid stability

250014 濟南，山東泉港藥業(yè)有限公司

粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)作為第一代重組基因工程藥物產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于自身骨髓移植、化療導(dǎo)致的粒細胞減少癥、艾滋病、再生障礙性貧血等疾病的治療，因其療效的特異性和確切性，被認為是開發(fā)的最為成功的細胞因子生物藥物之一。近年來，對基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)和生產(chǎn)成本的不斷提高，原有技術(shù)面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。原有發(fā)酵工藝落后，蛋白表達水平低，隨著對大腸桿菌生理代謝進行更深入的探索，使原核系統(tǒng)高密度發(fā)酵工藝研究不斷發(fā)展，例如:乙酸蓄積［1，2］、質(zhì)粒穩(wěn)定性等對高密度發(fā)酵的影響等。通過改造宿主菌、改變培養(yǎng)基的成分、發(fā)酵溫度、補料方式和添加抗生素［3-6］等方法，均可影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性從而改變目的蛋白的表達量，本研究通過改變工程菌的培養(yǎng)條件即在發(fā)酵過程中添加高濃度的金屬鹽如鈉鹽，鉀鹽，鎂鹽，探索適用于產(chǎn)業(yè)化的既簡單又實用的高產(chǎn)G-CSF發(fā)酵策略。