黃友如，陳義勇，朱東興，趙 陽，王嘆玉

(常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500)

源于不同加工條件下大豆分離蛋白的電子順磁共振分析

黃友如，陳義勇，朱東興，趙 陽，王嘆玉

(常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500)

分析比較幾種不同來源的大豆分離蛋白的電子順磁共振波譜(EPR)。結(jié)果表明：制備工藝條件不同，大豆分離蛋白EPR波譜中場(chǎng)碳自由基信號(hào)存在差異。降低蛋白提取過程中豆粕浸提的溫度或減少原料脫脂豆粕的殘留脂質(zhì)含量、鈍化原料脫脂豆粕中脂肪氧合酶活力，可使大豆分離蛋白中場(chǎng)碳自由基信號(hào)顯著減弱。

大豆分離蛋白；電子順磁共振；自由基

電子順磁共振(electron paramagnetic resonance，EPR)也稱電子自旋共振(electron spin resonance，ESR)，這兩個(gè)名稱在當(dāng)今國(guó)際文獻(xiàn)中并行通用，在我國(guó)常簡(jiǎn)稱為順磁。EPR是檢測(cè)未偶電子的唯一直接方法[1]，比核磁共振(NMR)具有更高的靈敏度。g因子，也稱光譜分裂因子，表征電子的自旋角動(dòng)量與其軌道角動(dòng)量對(duì)分子磁矩的相對(duì)貢獻(xiàn)。它是未偶電子所在分子的特征量，表明樣品EPR信號(hào)共振磁場(chǎng)的位置，是反映樣品分子結(jié)構(gòu)特征的重要參數(shù)，根據(jù)g因子可區(qū)別碳、氮和硫等中心自由基[2]。通過EPR，利用g因子黃友如等[3-4]研究了模擬體系中導(dǎo)致大豆蛋白聚集體形成的自由基由氧化亞油酸到大豆蛋白的遷移，并比較研究了不同微波功率下的大豆蛋白EPR波譜，確定了碳自由基、硫自由基、羥自由基和醛自由基等4種自由基類型。為更好地了解工業(yè)化生產(chǎn)過程中大豆蛋白自由基的性質(zhì)，闡明大豆蛋白制備過程中自由基形成及轉(zhuǎn)移機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以源于不同加工條件的大豆分離蛋白為原料，通過其EPR波譜的比較研究，探討制備方法對(duì)大豆蛋白碳自由基濃度的影響，為大豆蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(SPI-A) 東營(yíng)植物蛋白科技有限公司；大豆分離蛋白(SPI-B) 吉林不二蛋白有限公司；大豆分離蛋白(SPI-C、SPI-D、SPI-E) 本實(shí)驗(yàn)室制備；低溫脫脂豆粕 東海糧油工業(yè)(張家港)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 大豆分離蛋白的制備

樣品SPI-C的制備：在室溫條件下，將低溫脫脂豆粕按1:15(m/V)的料液比與水混合，用2mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至7.0。攪拌1h后，將其懸浮液在3000×g條件下離心30min，取上清液用2mol/L HCl溶液調(diào)pH值至4.5。靜置后在3000×g離心30min，取蛋白沉淀分散于水中并用2mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至7.0，噴霧干燥即得大豆分離蛋白(SPI-C)。噴霧干燥的條件為：漿料質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，進(jìn)口溫度168～175℃，出口溫度75～80℃，壓力0.4MPa。

樣品SPI-D的制備：浸提溫度由室溫改為50℃，浸提pH值由7.0提高到9.0，其他條件同樣品SPI-C的制備。

樣品SPI-E的制備：低溫脫脂豆粕→粉碎→過80目標(biāo)準(zhǔn)篩→乙醇和正己烷混合浸出(脫脂豆粕、95%乙醇、己烷質(zhì)量比1:4:2，20℃，2h)→離心分離(3000×g，30min)→沉淀→95%乙醇浸出(質(zhì)量比1:5，20℃，1h)→離心分離(3000×g，30min)→沉淀→真空干燥→低脂質(zhì)含量豆粕(LRSF)→粉碎→過80目標(biāo)準(zhǔn)篩→90℃真空加熱30min滅活脂肪氧合酶(LOX)→醇提濃縮蛋白→以醇提濃縮蛋白為原料制備大豆分離蛋白(SPI-E)，工藝條件同樣品SPI-D的制備。

1.3 分析方法

水分測(cè)定：105℃烘箱標(biāo)準(zhǔn)法[5]；蛋白質(zhì)測(cè)定：凱氏定氮法[5]；脂質(zhì)測(cè)定：氯仿-甲醇改良法[5]；脂肪氧合酶活力測(cè)定：參照Huang Youru等[6]的方法，樣品各指標(biāo)為3次測(cè)定的平均值。

1.4 EPR波譜檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取20mg大豆分離蛋白樣品，將其轉(zhuǎn)移至內(nèi)徑3.5mm石英樣品管中，使用JES-FA200 EPR波譜儀(日本JEOL公司)檢測(cè)。檢測(cè)條件：調(diào)制頻率100kHz，微波頻率9058.369MHz，微波功率0.998mW，中心磁場(chǎng)323.482mT，掃描寬度10mT，調(diào)制幅度0.5mT，信號(hào)增益范圍200～2000。

殘留脂質(zhì)的EPR波譜：將大豆分離蛋白經(jīng)氯仿-甲醇改良法[5]抽提所得的殘留脂質(zhì)，用移液槍分別移取0.5mL，將其轉(zhuǎn)移至內(nèi)徑3.5mm石英樣品管中，使用EPR波譜儀檢測(cè)，檢測(cè)條件同大豆分離蛋白樣品的EPR波譜檢測(cè)。

1.5g值的計(jì)算

采用雙標(biāo)樣法測(cè)量g因子，即采用錳標(biāo)的第3、4條峰做參考，其g值分別為2.0357和1.9804，校正ΔH＝0.449mT。根據(jù)下列共振公式[7]計(jì)算。

式中：h為普朗克(Planck)常數(shù)；β為玻爾磁子；v為微波頻率/GHz；H為磁場(chǎng)/kG(1G = 0.1mT)；H＝H測(cè)－ΔH。

2 結(jié)果與分析

2.1 各種類型豆粕及大豆分離蛋白的主要理化指標(biāo)及殘余脂肪氧合酶活力

表1 各種類型豆粕及大豆分離蛋白的主要理化指標(biāo)及殘余脂肪氧合酶活力Table 1 Some major components and LOX activity of different types of soybean flour and soybean protein isolates

從表1可以看出，脫脂豆粕中脂質(zhì)的含量和脂肪氧合酶的活力都很高，在工業(yè)生產(chǎn)中利用此類脫脂豆粕為原料，在較高的溫度(例如30～50℃)，pH值為7.0～9.0的條件下來制備大豆分離蛋白，脂肪氧合酶就會(huì)作用于脂質(zhì)，尤其是脂質(zhì)中多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的改性和功能性質(zhì)的變化[3]。本實(shí)驗(yàn)中脫脂豆粕經(jīng)乙醇與正己烷混合處理后，LRSF中脂質(zhì)含量和脂肪氧合酶活力均明顯降低，不及脫脂豆粕的10%。而且LRSF的脂肪氧合酶活力在90℃熱處理30min后又進(jìn)一步降低了。5種不同來源的大豆分離蛋白樣品，其蛋白質(zhì)和水分含量基本相同，僅殘留脂質(zhì)含量及脂肪氧合酶活力有差異，SPI-A、SPI-B、SPI-C和SPI-D的脂質(zhì)含量及脂肪氧合酶活力基本一致，但樣品SPI-E脂質(zhì)含量及脂肪氧合酶活力較低。

2.2 源于3種不同來源大豆分離蛋白殘留脂質(zhì)的EPR波譜

圖1 3種大豆分離蛋白殘留脂質(zhì)的EPR波譜Fig.1 EPR spectra of lipid from three kinds of soy protein isolates

應(yīng)用EPR波譜研究自由基產(chǎn)物，作為同類樣品的相對(duì)定量測(cè)定，在實(shí)驗(yàn)中忽略線寬的貢獻(xiàn)，只用EPR峰高近似表示吸收曲線的強(qiáng)度，且樣品中自旋粒子數(shù)量與吸收曲線強(qiáng)度成正比。由圖1可見，SPI-A、SPI-B和 SPI-C殘留脂質(zhì)在本實(shí)驗(yàn)中幾乎沒有EPR信號(hào)(樣品SPI-D和SPI-E殘留脂質(zhì)的EPR波譜與之相同，EPR信號(hào)極低，故未另外標(biāo)出)，因此后面實(shí)驗(yàn)觀察到的自由基信號(hào)僅在大豆蛋白存在的情況下才產(chǎn)生。

2.3 3種不同來源大豆分離蛋白的EPR波譜

圖2 3種大豆分離蛋白的EPR波譜Fig.2 EPR spectra of three kinds of soy protein isolates

由圖2所示，SPI-A和SPI-B的中場(chǎng)碳自由基信號(hào)強(qiáng)度基本一致，且中場(chǎng)EPR波譜幾近重合；但樣品SPI-C的中場(chǎng)碳自由基信號(hào)強(qiáng)度極弱，且中場(chǎng)EPR波譜與樣品SPI-A和SPI-B相比有明顯差異。樣品SPI-C的中場(chǎng)碳自由基信號(hào)強(qiáng)度僅是SPI-A或SPI-B樣品的12.8%。SPI-C與SPI-A、SPI-B的工藝差異主要是浸提溫度的不同，SPI-C為室溫，SPI-A、SPI-B通常為50℃?？梢娊釡囟葘?duì)SPI的中場(chǎng)碳自由基信號(hào)有明顯的影響。3種大豆分離蛋白EPR波譜中源于碳原子的中場(chǎng)自由基信號(hào)，其g值范圍在2.0051～2.0054之間(表2、圖2)。從信號(hào)的g值范圍、線寬及線型來看，該碳自由基或者位于蛋白質(zhì)骨架的α-碳原子上，或者位于蛋白質(zhì)側(cè)鏈的其他碳原子上[8-12]。

自由基是指含有奇數(shù)價(jià)電子并因此在一個(gè)軌道上具有一個(gè)未成對(duì)電子的原子或原子團(tuán)。自由基有3個(gè)顯著的特征，一是順磁性，二是反應(yīng)性強(qiáng)，三是壽命短。這些特點(diǎn)都與它存在未成對(duì)電子有關(guān)。分子成鍵過程中，電子都傾向于配對(duì)，自由基中的未成對(duì)電子也是如此。因此大多數(shù)自由基均是很活潑的，反應(yīng)性極強(qiáng)，容易反應(yīng)生成穩(wěn)定分子，此乃自由基的一個(gè)非常重要的性質(zhì)。那么，3種大豆分離蛋白EPR波譜的差異是在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的，還是在制備后的貯藏期間產(chǎn)生的？為此，將3種大豆分離蛋白分別保存在相同材質(zhì)的塑料密封袋中，常溫下保存30d后，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：貯藏時(shí)間等因素對(duì)粉末狀大豆分離蛋白的EPR波譜幾乎沒有影響(圖3、表3)，說明大豆分離蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)與實(shí)驗(yàn)室制備的工藝條件存在差異，該差異不僅影響終產(chǎn)品的脂質(zhì)含量與功能性質(zhì)，而且對(duì)大豆分離蛋白EPR波譜的中場(chǎng)碳自由基信號(hào)等也有明顯的影響。

表2 3種大豆分離蛋白的中場(chǎng)碳自由基信號(hào)Table 2 Central carbon radical singlet signal of three kinds of soy protein isolates

圖3 常溫下保存30d后的3種大豆分離蛋白EPR波譜Fig.3 EPR spectra of three kinds of soy protein isolates stored at room temperture for 30 days

表3 常溫下保存30d后的3種大豆分離蛋白中場(chǎng)碳自由基信號(hào)Table 3 Central carbon radical singlet signal of three kinds of soy protein isolates stored at room temperature for 30 days

與實(shí)驗(yàn)室制備相比較，工業(yè)化生產(chǎn)大豆分離蛋白的主要不同在于蛋白質(zhì)的浸提階段，工業(yè)化生產(chǎn)過程中，為了提高蛋白質(zhì)得率，浸提溫度通常為50℃，浸提pH值一般是9.0(有的為pH6.8)[13-14]。而低溫脫脂豆粕中脂肪氧合酶的活力較高(表1)，在蛋白浸提過程中，呈現(xiàn)較高的生物活性。Huang Youru等[15]應(yīng)用電子順磁共振(EPR)波譜研究了模擬體系中導(dǎo)致大豆蛋白聚集體形成的自由基由氧化亞油酸到大豆蛋白的遷移，證明大豆蛋白EPR波譜的中場(chǎng)碳自由基信號(hào)源于脂肪氧合酶催化亞油酸氧化所形成的自由基轉(zhuǎn)移而來。低溫脫脂豆粕中殘留脂質(zhì)含量較高約2.55%左右(表1)，在蛋白質(zhì)制備的浸提過程中如果溫度較高(如50℃)，浸提pH值適合(如pH9.0)，脂肪氧合酶可催化殘留脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸氧化，產(chǎn)生的自由基可轉(zhuǎn)移至大豆蛋白，進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氧化和/或聚集。因此，3種大豆分離蛋白EPR波譜的中場(chǎng)碳自由基信號(hào)的差異，可能是由于加工工藝條件的不同而造成的。

鑒于此，本研究調(diào)整了實(shí)驗(yàn)室制備大豆分離蛋白的工藝條件，采用兩種方法分別制備大豆分離蛋白SPI-D和SPI-E。SPI-D與SPI-E的區(qū)別在于，前者原料是低溫脫脂豆粕；而后者的原料是低溫脫脂豆粕經(jīng)過進(jìn)一步脫脂和滅酶處理，形成低脂質(zhì)含量與低脂肪氧合酶活力的醇提濃縮蛋白。兩者的浸提溫度均是50℃，浸提pH值均是9.0。將制備所得的大豆分離蛋白(SPI-D和SPI-E)做EPR波譜檢測(cè)，結(jié)果見圖4、表4。

圖4 大豆分離蛋白SPI-D和SPI-E的EPR波譜Fig.4 EPR spectra of sample SPI-D and SPI-E

表4 大豆分離蛋白SPI-D和SPI-E的中場(chǎng)碳自由基信號(hào)Table 4 Central carbon radical singlet signal of samples SPI-D and SPI-E

由表4、圖4可知，在以低溫脫脂豆粕為原料制備大豆分離蛋白的過程中，采用pH9.0浸提條件恰是脂肪氧合酶的最佳反應(yīng)pH值范圍，若浸提溫度較高(如50℃)，脂肪氧合酶的活力進(jìn)一步增加，催化浸提液中殘留脂質(zhì)的不飽和脂肪酸氧化，產(chǎn)生自由基可轉(zhuǎn)移至大豆蛋白，導(dǎo)致大豆蛋白中場(chǎng)碳自由基信號(hào)的增強(qiáng)；降低原料脫脂豆粕的殘留脂質(zhì)含量，同時(shí)鈍化原料脫脂豆粕中脂肪氧合酶活力，可使大豆分離蛋白中場(chǎng)碳自由基信號(hào)顯著減弱。

值得注意的是，作為食品添加劑，工業(yè)化生產(chǎn)的大豆分離蛋白中較強(qiáng)的自由基信號(hào)，在含有大豆蛋白的食品加工過程中，將會(huì)發(fā)生進(jìn)一步的變化，進(jìn)而對(duì)終產(chǎn)品的品質(zhì)產(chǎn)生影響，相關(guān)的研究正在進(jìn)行中。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)比較了3種不同來源大豆分離蛋白的EPR波譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種大豆分離蛋白EPR波譜的中場(chǎng)碳自由基信號(hào)存在差異，分離3種不同來源大豆分離蛋白中的殘留脂質(zhì)，并在相同條件下做EPR分析，結(jié)果表明此條件下殘留脂質(zhì)的EPR波譜自由基信號(hào)極其微弱，說明實(shí)驗(yàn)觀察到的自由基信號(hào)僅在大豆蛋白存在的情況下才產(chǎn)生。進(jìn)一步研究表明制備大豆分離蛋白的工藝條件不同，是造成其EPR波譜中場(chǎng)碳自由基信號(hào)差異的主要原因。降低蛋白提取過程中豆粕浸提的溫度或減少原料脫脂豆粕的殘留脂質(zhì)含量、鈍化原料脫脂豆粕中脂肪氧合酶活力，可使大豆分離蛋白中場(chǎng)碳自由基信號(hào)顯著減弱。

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Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy (EPR) Study of Soybean Protein Isolates Prepared by Different Processing Methods

HUANG You-ru，CHEN Yi-yong，ZHU Dong-xing，ZHAO Yang，WANG Tan-yu
(School of Biological Science and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

Soybean protein isolates were prepared by different methods and comparatively analyzed by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The results showed that soybean protein isolates obtained by different methods were different in central singlet signal attributed to the carbon radical (gvalue ranged between 2.0051 and 2.0054). The central free radical signal of soybean protein isolates could be weakened by decreasing extraction temperature, reducing lipid contents of defatted soybean flakes or inactivating lipoxygenase activity.

soybean protein isolates；electron paramagnetic resonance(EPR)；free radicals

TS201.21；TQ645.99

A

1002-6630(2012)05-0098-04

2011-05-04

江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(10KJB550001)；蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(SYND201003)

黃友如(1966—)，男，副教授，博士，主要從事生物高分子及植物蛋白的基礎(chǔ)研究與開發(fā)。E-mail：huangyouru@yahoo.com.cn