朱偉明，梁新義,2,*，龐廣昌，康曉斌，崔 蘭

(1.天津商業(yè)大學(xué) 天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300134；2.天津商業(yè)大學(xué)理學(xué)院，天津 300134；3.天津大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072)

基于金鈀納米合金修飾的過氧化氫傳感器的研制

朱偉明1，梁新義1,2,*，龐廣昌1，康曉斌1，崔 蘭3

(1.天津商業(yè)大學(xué) 天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300134；2.天津商業(yè)大學(xué)理學(xué)院，天津 300134；3.天津大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072)

研制金鈀合金納米粒子修飾的特異性定量檢測(cè)食品中過氧化氫殘留量的過氧化氫傳感器。以比表面積大、生物相容性好、具有優(yōu)良電催化性能的金鈀合金納米粒子固定辣根過氧化物酶于玻碳電極，制得過氧化氫傳感器電極。通過循環(huán)伏安法及交流阻抗法表征電極在組裝過程中的電化學(xué)特性，利用計(jì)時(shí)電流法對(duì)傳感器性能進(jìn)行考察。研究表明：該傳感器測(cè)定H2O2的線性范圍為1×10-7～5×10-3mol/L，檢測(cè)限為8.0×10-7mol/L，對(duì)H2O2具有較好的催化還原活性和良好的檢出性能。該傳感器制作簡(jiǎn)單、成本低廉、可重復(fù)性強(qiáng)，可用于快速定量檢測(cè)食品中過氧化氫殘留量。

過氧化氫傳感器；金鈀合金納米粒子；玻碳電極；計(jì)時(shí)電流法

過氧化氫(H2O2)具有高效殺菌、氧化漂白作用和易分解、低殘留的特點(diǎn)，很多食品生產(chǎn)企業(yè)超量或非法添加過氧化氫，用來殺滅食品、包裝材料及設(shè)備容器中的微生物和增加食品的色悅感[1-2]。我國(guó)食品衛(wèi)生法規(guī)定食品及保健品中不得有過氧化氫殘留。隨著社會(huì)的進(jìn)步和生活水平的提高，關(guān)于過氧化氫的殘留危害日漸引起人們的關(guān)注，研究表明，過氫化氫進(jìn)入人體后直接刺激黏膜組織，并且通過化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致人體細(xì)胞癌變，加速人體的衰老或誘發(fā)心血管疾病等[3-4]。同時(shí)由于傳統(tǒng)的過氧化氫檢測(cè)方法復(fù)雜且耗時(shí)較長(zhǎng)，因此傳感器技術(shù)用于H2O2檢測(cè)以其快速、高靈敏度和高選擇性引起了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注[5-6]。

納米金由于其具有大比表面積、獨(dú)特的“吸電子效應(yīng)”以及良好的生物相容性而被廣泛用于固定辣根過氧化物酶進(jìn)行H2O2的檢測(cè)和催化反應(yīng)研究[7-8]，但其成本高，催化活性較低；而納米Pd以其廉價(jià)和良好的催化性能被用于甲醇、乙醇和甲酸的氧化[9-10]及H2O2的還原[11-12]等。在研究金鈀合金納米粒子的合成及催化性質(zhì)的國(guó)內(nèi)外報(bào)道中，所合成的金鈀合金納米粒子大多是以負(fù)載形式存在的，合成方法與成本都較高，如Xu等[13]以金屬無機(jī)鹽為前體，加入一定量的碳粉，在水溶液中超聲1h制備得Pd3Au/C、Pd7Au/C、PdAu/C納米粒子，Tian等[14]將制備好的TiO2納米管與金屬無機(jī)鹽前體混合均勻后經(jīng)紫外照射30min后得到TiO2納米管負(fù)載的AuPd納米材料。負(fù)載材料的優(yōu)劣控制著AuPd納米合金粒子的活性大小，而負(fù)載后的AuPd納米合金粒子顆粒尺寸與形貌難以控制，粒子本身結(jié)構(gòu)與特性難于測(cè)試，表現(xiàn)不出納米系統(tǒng)的優(yōu)異性能。本實(shí)驗(yàn)將合成無任何負(fù)載的金鈀合金納米粒子，方法簡(jiǎn)單而具有獨(dú)創(chuàng)性，所合成粒子性質(zhì)穩(wěn)定、催化活性高，利用它吸附辣根過氧化物酶制備的過氧化氫電極選擇性高，成本低廉，可重復(fù)性強(qiáng)，用于制備第3代無媒介過氧化氫生物傳感器，快速定量檢測(cè)食品中過氧化氫殘留量。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

辣根過氧化物酶(H R P，冰凍保存)、氯金酸(HAuClO4，分析純)、1-金剛烷甲酸(分析純) 美國(guó)Sigma試劑公司；氯化鈀(PdCl2) 天津金海華興科技發(fā)展有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(分析純) 比利時(shí)Acros試劑公司；油酸、硼氫化鉀(均為分析純) 天津化學(xué)試劑一廠；H2O2溶液(體積分?jǐn)?shù)30%) 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所用溶液均用0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(pH7.2～7.4)配制，蒸餾水為MilliQ電導(dǎo)水。

Rigaku D/max2500VB+/PC型X-射線粉末衍射儀(XRD)(銅靶，掃描范圍為20°～90°，掃描速率8°/min)日本Rigaku公司；TV9761/55MEEDS X射線能譜儀(TEM)、Tecnai G2 F20型場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(HRTEM)荷蘭菲利普公司；HI670電化學(xué)工作站[工作電極為玻碳電極(glassy carbon electrode，GCE)(φ＝3mm)，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極] 上海辰華儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Au-Pd合金納米粒子的合成及表征

在室溫下，取5mLN,N-二甲基甲酰胺加入圓底燒瓶中，然后分別加入125μL的0.162mol/L HAuCl4溶液，125μL的0.162mol/L PdCl2溶液，磁力攪拌，待溶液澄清透明后，加入1-金剛烷甲酸約0.1600g，攪拌至完全溶解；加入250μL油酸，超聲1min。在磁力攪拌下將50μL硼氫化鉀溶液按每毫升水0.1800g的比例緩慢滴加到溶液中，恒速攪拌1h后停止，即得棕黑色Au-Pd納米顆粒懸浮液。

合成的Au-Pd樣品經(jīng)無水乙醇(4000r/min離心5min)兩次洗滌，N,N-二甲基甲酰胺分散溶解后，滴加在超薄碳膜上，自然晾干后以TEM進(jìn)行高分辨觀測(cè)及EDS分析；將經(jīng)無水乙醇離心洗滌的Au-Pd樣品在玻片上涂膜，自然干燥后進(jìn)行XRD測(cè)試，掃描范圍20°～90°。

1.2.2 過氧化氫傳感器的制備

將玻碳電極(GC，φ＝3mm)依次在載有1.0、0.3、0.05μm Al2O3顆粒的絨毛墊上拋光處理后，用二次蒸餾水沖洗干凈，分別在無水乙醇及超純水中超聲處理各1min，自然晾干后備用。

將合成的Au-Pd樣品經(jīng)乙醇(4000r/min離心5min)兩次洗滌后再分散于乙醇中，配制成質(zhì)量濃度5mg/mL的Au-Pd乙醇溶液，滴加100μL于玻碳電極表面，使其均勻鋪展，自然晾干后即得Au-Pd/GC電極。

將凍冷干燥的HRP配制成質(zhì)量濃度為50mg/mL(50mg過氧化氫酶溶于lmL超純水中)的酶溶液，于冰箱中存放(4℃)，滴加15μL酶溶液至Au-Pd/GC電極表面，使其均勻鋪展，在冰箱內(nèi)(4℃)自然晾干后即得HRP/Au-Pd/GC電極。

1.2.3 過氧化氫傳感器的測(cè)定

采用三電極系統(tǒng)，以不同修飾階段的玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，以0.01mol/L的pH7.2～7.4的PBS緩沖液為測(cè)試底液，先進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試，進(jìn)一步用交流阻抗法(10-2～106Hz)表征電極在自組裝過程中的電化學(xué)特性。

采用計(jì)時(shí)電流法對(duì)傳感器性能進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)在PBS緩沖液中進(jìn)行，計(jì)時(shí)電流法測(cè)定時(shí)，工作電位為0.5V。所有電化學(xué)測(cè)定實(shí)驗(yàn)均在25℃條件下進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 Au-Pd粒子的形貌表征

圖1a表明合成的Au-Pd納米粒子為球形，顆粒大小均勻，粒徑分布窄；圖1b表明該粒子平均粒徑為(4.5±0.5)nm，表面缺陷較多；圖1c表明，衍射峰的2θ角分別為38.82°、45.16°、65.62°、78.66°和 82.08°，分別對(duì)應(yīng)面心立方結(jié)構(gòu)的(111)、(200)、(220)、(311)族和(222)族，與 Au的衍射峰(PDF#65-2870)相比，Au-Pd合金納米粒子各晶面的2θ角均略有增大，說明由原子半徑較小的Pd隨機(jī)取代晶格中的Au使得晶面間距減??；由EDS測(cè)試結(jié)果(圖1d)表明粒子中原子含量比Au:Pd為71:29。由形貌表征結(jié)果顯示了本實(shí)驗(yàn)合成的金鈀合金納米粒子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，表面缺陷多，具有較高的催化活性，可用于制備過氧化氫傳感器電極。

圖1 合成的金鈀合金納米粒子的形貌表征Fig.1 Spectra of Au-Pd nano-alloy

2.2 電極自組裝過程中的電化學(xué)特性

2.2.1 循環(huán)伏安表征

圖2 玻碳電極不同修飾階段的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of glassy carbon electrode at different stages of modification

電極每次修飾后，在7mL 5.0×10-3mol/L H2O2的PBS溶液中，以1.0～－0.2V的電位范圍，0.05V/s的掃描速度進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)定，所得循環(huán)伏安曲線如圖2所示。由圖可見：未修飾的玻碳電極掃描時(shí)接近直線，表明電極表面已處理光滑潔凈；當(dāng)以Au-Pd修飾電極后，掃描電流強(qiáng)度明顯增加，表明Au-Pd已經(jīng)固定在了玻碳電極表面并發(fā)揮了Au-Pd合金納米材料良好的傳遞電子的作用；納米電極吸附HRP后，掃描曲線在0.4V左右出現(xiàn)氧化峰，并且電流強(qiáng)度增大2倍，表明HRP已經(jīng)吸附在了納米粒子表面并發(fā)揮了催化氧化作用。

2.2.2 交流阻抗表征

圖3 玻碳電極不同修飾階段的交流阻抗圖Fig.3 AC impedance plots of glassy carbon electrode at different stages of modification

應(yīng)用交流阻抗技術(shù)表征了電極組裝過程。如圖3a所示，玻碳電極交流阻抗譜在40Ω處為一垂直于橫軸的直線，表明玻碳電極表面沒有發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，電荷傳遞僅受擴(kuò)散控制；當(dāng)玻碳電極表面組裝納米Au-Pd后(圖3b)，高頻區(qū)出現(xiàn)小的圓弧且直線部分與橫軸夾角約為4°，說明Fe(CN)63-/Fe(CN)4-在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，且電極過程為電化學(xué)和擴(kuò)散聯(lián)合控制過程[15]；當(dāng)納米AuPd修飾的玻碳電極表面吸附辣根過氧化物酶后交流阻抗曲線在高頻區(qū)的半圓弧半徑明顯增大且直線部分與橫軸的夾角增大，如圖3c所示，表明HRP/Au-Pd/GCE電極表面電化學(xué)反應(yīng)阻抗增加，電荷擴(kuò)散阻抗增加，且電極過程同樣是電化學(xué)和擴(kuò)散聯(lián)合控制過程。交流阻抗表征結(jié)果同時(shí)證明了HRP/Au-Pd/GC電極的組裝方法是可行的。

2.3 過氧化氫傳感器性能的測(cè)定

圖4表明，在電壓為1.0V時(shí)電流響應(yīng)值達(dá)到最大，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)隨H2O2濃度的增加而增加，線性范圍為1×10-7～5×10-3mol/L。

圖4 金鈀合金納米粒子修飾的辣根過氧化物酶玻碳電極濃在不同濃度H2O2緩沖液(0.01mol/L PBS，pH7.2)中的循環(huán)伏安曲線Fig.4 CV curves of HRP/Au-Pd/GCE detected in different concentrations of H2O2

圖5 HRP/ Au-Pd /GCE檢測(cè)H2O2的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)曲線(A)和線性關(guān)系(B)Fig. 5 Electric current response curve (A) and linear curve (B) of HRP/ Au-Pd /GCE

在工作電位為0.5V、電磁攪拌條件下向7mL的PBS緩沖溶液中每隔20s注入10μL 5×10-3mol/L的H2O2溶液，由圖5A可知，響應(yīng)電流隨H2O2濃度成階梯狀增加，達(dá)到穩(wěn)態(tài)電流時(shí)所需時(shí)間低于10s。圖5B表明，在線性范圍內(nèi)，響應(yīng)電流與H2O2濃度呈線性關(guān)系(R2＝0.9952)，線性回歸方程為y＝2.7735x＋2.2131，檢出限為8.0×10-7mol/L(檢測(cè)限公式為DL＝3Sb/k，其中Sb為標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為斜率，RSN＝3)。表明金鈀合金納米粒子修飾酶生物傳感器對(duì)H2O2有良好的檢出性能。

2.4 過氧化氫傳感器性能的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性

應(yīng)用循環(huán)伏安法，以響應(yīng)電流值評(píng)價(jià)HRP/Au-Pd/GCE修飾電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。以HRP/Au-Pd/GCE修飾電極重復(fù)15次在濃度為0.005mol/L的H2O2中測(cè)定循環(huán)伏安曲線，結(jié)果表明，重復(fù)15次時(shí)與第1次測(cè)試相比其響應(yīng)電流僅降低了5%，室溫放置15d，在放置期間歇性使用，其響應(yīng)信號(hào)稍有變化，但變化量沒有超過1%，說明經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間放置后該電極的微結(jié)構(gòu)基本沒有變化，酶活力得以保持，具有較好的穩(wěn)定性。同時(shí)制備3支電極，分別在H2O2濃度為0.005mol/L的溶液中對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，3支電極其響應(yīng)電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%，說明該過氧化氫生物傳感器具有良好的重現(xiàn)性。HRP/Au-Pd/GCE過氧化氫生物傳感器良好的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性表明，合成的AuPd納米粒子對(duì)辣根過氧化物酶具有很好的固定作用和保持酶生物活性的作用。

3 結(jié) 論

以金鈀合金納米粒子修飾辣根過氧化物酶制備的過氧化氫傳感器具有靈敏度高、檢測(cè)限低、可重復(fù)性好的特點(diǎn)，該傳感器制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉，為食品中過氧化氫含量的快速測(cè)定提供了新的方法和思路。

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Development of Hydrogen Peroxide Sensor Modified by Gold-Palladium Nano-Alloys

ZHU Wei-ming1，LIANG Xin-yi1,2,*，PANG Guang-chang1，KANG Xiao-bin1，CUI Lan3
(1. Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China；2. School of Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China；3. School of Materials Science and Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China)

A new type of biosensor for detecting hydrogen peroxide in food residues was developed through modification of gold-palladium nano-alloys on the glassy carbon electrode. Due to large surface area, good biocompatibility and excellent catalytic properties of nano particles, the gold-palladium nano-alloy was used to immobilize horseradish peroxidase (HRP) on glassy carbon electrode. The electrochemical properties of electrode surface during each fabrication procedure were characterized by cyclic voltammetry and AC impedance method and the sensor performance of this sensor was evaluated by chronoamperometry.The results revealed that the hydrogen peroxide sensor had a good linear relationship in the range of 1× 10-7—5 × 10-3mol/L for H2O2 and the limit of detection was 8.0×10-7mol/L. It had better catalytic activity and good detection performance for detecting hydrogen peroxide. Moreover, this hydrogen peroxide sensor proved inexpensive, easy to use and strong repeatability, thus it is applicable for the hydrogen peroxide in food residues.

hydrogen peroxide sensor；gold-palladium nano-alloys；chronoamperometry；AC impedance

TS207.3

B

1002-6630(2012)10-0311-04

2012-01-19

天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(06YFJMJC12600)；天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(10JCZDJC23600)；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(20071108)；“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD04A00)

朱偉明(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸づc貯藏。E-mail：mmc-2000@163.com

*通信作者：梁新義(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)榧{米材料的合成、組裝及其在催化和食品痕量物質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用。E-mail：lxyi@tjcu.edu.cn