劉 月，李書倩，張 博，劉長(zhǎng)江，辛 廣,,*

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.鞍山師范學(xué)院化學(xué)系，遼寧 鞍山 114007)

軟棗獼猴桃多聚半乳糖醛酸酶提取條件的優(yōu)化

劉 月1,2，李書倩1,2，張 博2，劉長(zhǎng)江1，辛 廣2,1,*

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.鞍山師范學(xué)院化學(xué)系，遼寧 鞍山 114007)

以軟棗獼猴桃為實(shí)驗(yàn)材料，確定多聚半乳糖醛酸酶最優(yōu)提取條件和最適活性分析條件。在提取過程中，以酶比活力為指標(biāo)確定緩沖液的最適pH值、離子濃度、DTT添加量對(duì)PG提取效果的影響，通過正交試驗(yàn)確定最佳提取條件。結(jié)果表明：最優(yōu)提取條件為pH5.5、0.05mol/L 乙酸緩沖液為提取液，加入0.1mol/L NaCl、1mmol/L DTT；最適活性分析條件為反應(yīng)溫度40℃、反應(yīng)時(shí)間90min。

軟棗獼猴桃；多聚半乳糖醛酸酶；提取；活性分析

軟棗獼猴桃(Actinidia argutaSieb．et Zuec.)，又名軟棗子、獼猴梨、藤瓜，屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)多年生落葉藤本植物[1]。軟棗獼猴桃果實(shí)翠綠，清香爽口，柔軟多汁，尤其富含VC，其含量高達(dá)450mg/100g，是蘋果、梨的80～100倍。果實(shí)中還含有VB、氨基酸、類胡蘿卜素及鎂、鐵、鉀、鈉等多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有滋補(bǔ)強(qiáng)身、生津潤(rùn)肺等作用，對(duì)高血壓、心絞痛、高血脂等有一定療效[2]。軟棗獼猴桃具有營(yíng)養(yǎng)豐富、醫(yī)療效能和觀賞價(jià)值的同時(shí)具有不耐貯藏的致命弱點(diǎn)，極易軟化，使其開發(fā)利用受到極大限制[1]。20世紀(jì)60年代初Hobson指出多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase EC 3.2.1.15，PG)與番茄果實(shí)軟化密切相關(guān)，后研究證明該酶是一種細(xì)胞壁蛋白[3-8]，它可以催化果膠分子中α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解，伴隨著植物發(fā)育的許多階段，參與果膠的降解，與果實(shí)的軟化、脫落和種子成熟及植物組織的抗病性有關(guān)[9-12]。楊德興等[13]認(rèn)為在果實(shí)后熟過程中，隨著PG活性不斷提高，原果膠逐步降解為可溶性果膠，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，果肉硬度下降，導(dǎo)致果實(shí)軟化。因此研究軟棗獼猴桃PG的性質(zhì)，進(jìn)一步了解其軟化機(jī)理，抑制或減緩其果肉組織中PG活性的提高，可增強(qiáng)果實(shí)抵御外界不良因素的能力和耐藏性，延長(zhǎng)其貨架壽命。同時(shí)為軟棗獼猴桃貯藏保鮮及加工技術(shù)的研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃采摘于2010.9.2鞍山千山，硬度2.44(kg/cm2)，可溶性固形物含量9.72%；95%乙醇、無(wú)水乙酸鈉、冰乙酸均為分析純；多聚半乳糖醛酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白、3,5-二硝基水楊酸(DNS)。

1.2 儀器與設(shè)備

CR22E冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；UV-2450紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司；BS124S 電子天平賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；PHS-2C型數(shù)顯pH計(jì) 上海智光儀器儀表有限公司；Eppendorf 移液器 德國(guó)普蘭德公司。

1.3 方法

1.3.1 PG提取

稱取10g軟棗獼猴桃置于經(jīng)預(yù)冷的研缽中，用液氮研磨成粉末，加入20mL經(jīng)預(yù)冷的95%乙醇，研磨勻漿后，全部轉(zhuǎn)入離心管中，低溫放置10min，經(jīng)4℃、12000r/min離心20min。傾去上清液，向沉淀物中再加入10mL經(jīng)預(yù)冷的80%乙醇，振蕩，低溫放置10min，然后在相同條件下離心。再傾去上清液，向沉淀物中加入5mL經(jīng)預(yù)冷的乙酸緩沖液(內(nèi)含0.1mol/L NaCl、1.0mmol/L DTT)，于4℃放置提取1h，再經(jīng)過離心后收集上清液即為粗酶提液，4℃保存?zhèn)溆肹14-16]。

1.3.2 PG活性測(cè)定

采用DNS比色法[16-18]測(cè)定PG活力。取2支25mL具塞刻度試管，編號(hào)0、1，每支試管中都分別加入1.0mL(50mmol/L、pH5.5)乙酸-乙酸鈉緩沖液和0.2mL(10g/L) 多聚半乳糖醛酸溶液。再往1號(hào)試管中加入0.2mL酶提取液，0號(hào)試管作為空白對(duì)照，混勻后置于40℃水浴中保溫1.5h。保溫后，迅速加入1.5mL 3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS)，向0號(hào)試管中加入0.2mL酶提取液，搖勻，在沸水浴中加熱5min。然后迅速冷卻至室溫，以蒸餾水稀釋至25mL刻度處，混勻。在540nm波長(zhǎng)處，用0號(hào)試管作為參比調(diào)零，測(cè)定1號(hào)試管中溶液的吸光度。重復(fù)3次。

1個(gè)酶活力單位定義：以每小時(shí)每克軟棗獼猴桃在40℃催化多聚半乳糖醛酸水解生成1mg半乳糖醛酸的質(zhì)量表示，即1U＝1mg/(h·g)。

式中：m＇為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的葡萄糖質(zhì)量/mg；V為樣品提取液總體積/mL；Vs為測(cè)定時(shí)所取樣品提取液體積/mL；t為酶促反應(yīng)時(shí)間/h；m為樣品質(zhì)量/g；1.08為葡萄糖換算成半乳糖醛酸的系數(shù)(取值194/180)。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

參照Bradford等[19]的方法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。吸取1.0mL樣品提取上清液(視蛋白質(zhì)含量適當(dāng)稀釋)，放入具塞試管中，加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，充分混合，放置5min后在波長(zhǎng)595nm處比色，測(cè)定吸光度。重復(fù)3次。

1.3.4 PG提取條件的優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

在其他條件一定時(shí)，提取緩沖液pH值采用 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0乙酸緩沖液(0.05mol/L)，提取緩沖液離子濃度采用 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L NaCl溶液，向提取緩沖液中添加1mmol/L DTT、1mmol/L EDTA、20%甘油、1% Triton X-100，向提取緩沖液中分別添加0、0.5、1.0、1.5、2.0mol/L DDT，粗酶液反應(yīng)溫度采用30、40、50、60、70℃，粗酶液反應(yīng)時(shí)間30、60、90、20、150、180min，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取液pH值、提取液離子濃度、DTT添加量進(jìn)行三因素三水平L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到最佳提取條件。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所得數(shù)據(jù)為3次平均值，進(jìn)行正交試驗(yàn)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 緩沖液pH值對(duì)PG提取的影響

圖1 緩沖液pH值對(duì)PG活力的影響Fig.1 Effect of pH on PG activity

用0.05mol/L乙酸緩沖作為提取緩沖液，選取4.0、4.5、5.0、5.5、6.0五個(gè)不同pH值，按照1.3.1節(jié)的方法提取粗酶液后，按照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)方法測(cè)定不同提取液酶活力和蛋白質(zhì)含量，研究不同pH值條件對(duì)酶

提取效果的影響。由圖1可見，當(dāng)緩沖液pH值由4.0逐步提高到5.5時(shí)，PG活力及比活力隨pH的提高而逐漸增大，在pH5.5時(shí)提取酶液的酶活力及比活力呈現(xiàn)最高，當(dāng)pH6.0時(shí)，PG比活力明顯下降。本實(shí)驗(yàn)選用pH4.5、5.0、5.5進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2 緩沖液離子強(qiáng)度對(duì)PG提取的影響

圖2 緩沖液離子濃度對(duì)PG活力的影響Fig.2 Effect of ion concentration in buffer pH on PG activity

在上述提取緩沖液的基礎(chǔ)上，添加NaCl，使其濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L。由圖2可以看出，在乙酸緩沖液中加入NaCl后，明顯影響了粗酶液中PG的活力。當(dāng)緩沖液離子濃度為0.1mol/L時(shí)，PG活力高于其他濃度，明顯高與對(duì)照組(0mol/L)42.0%。之后隨著緩沖液離子濃度的增加，PG活力逐步降低，濃度增加0.5mol/L時(shí)，PG活力最低，明顯低于對(duì)照組41.4%，說(shuō)明高離子濃度反而抑制了PG活力。本實(shí)驗(yàn)選用0.1、0.2、0.3mol/L NaCl進(jìn)行正交試驗(yàn)，比較不同離子濃度對(duì)PG活力的影響。

2.1.3 不同添加物對(duì)PG提取的影響

圖3 不同添加物對(duì)PG活力的影響Fig.3 Effect of additive composition on PG activity

在上述提取緩沖液的基礎(chǔ)上，添加1mmol/L DTT、1mmol/L EDTA、20%甘油、1% Triton X-100，研究不同添加物對(duì)酶提取效果的影響。由圖3可知，在pH5.5乙酸緩沖液中分別添加DTT、EDTA、甘油、Triton X-100后，除甘油外的3種添加物均不同程度地提高了粗酶提取液中PG的活力，其中DTT的效果高于其他添加物。說(shuō)明在提取緩沖液種加入DTT可以提高PG的提取活力。

2.1.4 DTT添加量對(duì)PG提取的影響

圖4 DTT添加量對(duì)PG活力的影響Fig.4 Effect of DTT addition amount on PG activity

在2.1.2節(jié)提取緩沖液的基礎(chǔ)上，添加DTT，使其濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0mmol/L，研究DTT濃度對(duì)酶提取效果的影響。DTT為常用還原劑，有抗氧化作用。它能保護(hù)酶分子上的還原性基團(tuán)，維持還原性環(huán)境，穩(wěn)定酶的活性。由圖4可知，隨著DTT濃度的增加，PG活力呈上升趨勢(shì)，當(dāng)DTT濃度達(dá)到1.0mmol/L時(shí)，PG活力達(dá)到最大值，之后隨著濃度的增大，PG呈下降趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)選用0、0.5、1.0mmol/L DTT進(jìn)行正交試驗(yàn)，比較不同DTT濃度對(duì)PG活力的影響。

2.1.5 溫度對(duì)粗酶液PG活力的影響

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)粗酶液PG活力的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on PG activity

將粗酶液反應(yīng)體系分別在30、40、50、60、70℃反應(yīng)溫度下保溫90min。由圖5可以看出，反應(yīng)溫度在40～60℃之間酶活性良好，當(dāng)反應(yīng)溫度在40℃時(shí)，PG活力最高，隨著溫度的不斷升高，PG活力逐漸下降。雖然高溫度可加速酶促反應(yīng)的進(jìn)行，但同時(shí)加速酶變性而減少有活性酶的數(shù)量，降低催化作用。

2.1.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)粗酶液PG活力的影響

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)粗酶液PG活力的影響Fig.6 Effect of reaction time on PG activity

將粗酶液反應(yīng)體系置于40℃條件下，分別保溫30、60、90、120、150、180min。由圖6可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，PG活力也隨之逐漸提高，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到90min時(shí)，酶活力最高，其后隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)一步的增加，PG活力下降，但下降幅度不大。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定PG提取條件正交的考察因素及水平，以酶比活力為指標(biāo)，因素水平及結(jié)果見表1。

表1 PG提取條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Design and results of orthogonal tests for optimizing extraction conditions of PG

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上做正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取條件。選取緩沖液pH(A)、緩沖液離子濃度(B)、DTT添加量(C)3個(gè)因素，以PG比活力為指標(biāo)，優(yōu)化出PG最優(yōu)提取條件。綜合分析表1可知，影響PG提取條件的因素顯著(R值)次序?yàn)锽＞C＞A，即緩沖液離子濃度對(duì)PG比活力影響最大。由此得出PG最優(yōu)提取條件：以50mmol/L pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液為提取液，加入0.1mol/L NaCl、1.0mmol/L DTT提取效果為最佳。

3 結(jié) 論

通過單因素及正交試驗(yàn)，各因素對(duì)PG提取效果作用大小依次為：緩沖液離子濃度、DTT添加量、緩沖液pH值。PG最優(yōu)提取條件：以50mmol/L pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液為提取液，加入0.1mol/L NaCl、1.0mmol/L DTT提取效果為最佳；PG最適活性分析條件為反應(yīng)溫度40℃、反應(yīng)時(shí)間90min。

絕大多數(shù)微生物所產(chǎn)生的多聚半乳糖醛酸酶的最適反應(yīng)pH值都在酸性范圍，一般在pH3.5～5.5之間，并且在酸性環(huán)境中表現(xiàn)出較好的酶活穩(wěn)定性，屬于酸性果膠酶[20]。稀鹽溶液中的離子可以減少蛋白質(zhì)分子極性基團(tuán)之間的靜電引力，加強(qiáng)蛋白質(zhì)與提取液之間的相互作用，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn)[21]。鹽濃度一般控制在0.02～0.5mol/L范圍內(nèi)，常用的鹽溶液為NaCl溶液[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為向提取緩沖液中加入0.1mol/L NaCl，可見低濃度鹽溶液對(duì)酶穩(wěn)定性好、溶解度大。

[1] 樸一龍, 趙蘭花. 軟棗獼猴桃研究進(jìn)展[J]. 北方園藝, 2008(3)∶ 76-78.

[2] 趙淑蘭. 軟棗獼猴桃品種簡(jiǎn)介[J]. 特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物, 2002, 5(2)∶ 35-36.

[3] 段學(xué)武, 張昭其, 季作梁. PG酶與果實(shí)的成熟軟化[J]. 果樹學(xué)報(bào),2001, 18(4)∶ 229-233.

[4] 程杰山, 沈火林, 孫秀波, 等. 果實(shí)成熟軟化過程中主要相關(guān)酶作用的研究進(jìn)展[J]. 北方園藝, 2008(1)∶ 49-52.

[5] 張海新, 及華. 果實(shí)成熟軟化及相關(guān)酶學(xué)研究[J]. 食品科技, 2008,33(11)∶ 57-59.

[6] 薛炳燁, 束懷瑞. 多聚半乳糖醛酸酶(PG)與果實(shí)成熟軟化研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002, 33(2)∶ 252-256.

[7] 白延紅, 馬勝利, 秦靜遠(yuǎn), 等. 多聚半乳糖醛酸酶(PG)與果實(shí)成熟軟化的影響[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008(4)∶ 86-88.

[8] RONALD P, VRIES D, JAAP V, et al. Aspergillus enzymes involved in degradation of plant cell wall polysaccharides [J]. Microbiol Mol Biol R, 2001, 65(4)∶ 497-522.

[9] DAVID A. Modification of expansin protein abundance in tomato fruit alters softening and cell wall polymer metabolism during ripening[J].The Plant cell, 1999(11)∶ 2203- 2216 .

[10] KRISTEN A, ALAN B. Polygalacturonases∶ many genes in search of a function[J]. Plant Physiol, 1998, 117(2)∶ 337-343.

[11] PIETRO A, MADRID M, CARACUEL Z, et al. Fusarium oxysporum∶exploring the molecular arsenal of a vascular wilt fungus[J]. Molecular Plant Pathol, 2003, 4(1)∶ 315-325.

[12] SCOTT S, CHENG Y, CERVONE F, et al. Targeted mutants ofCochiobolus carbonumlacking the two major extracellular polygalacturonases[J]. Appl Environ Microb, 1998, 64(1)∶ 1497-1503.

[13] 楊德興, 戴京晶, 龐向宇, 等. 獼猴桃衰老過程中PG、果膠質(zhì)和細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)的變化[J]. 園藝學(xué)報(bào), 1993, 20(4)∶ 341-345.

[14] 毛存貴, 王克夷. 多聚半乳糖醛酸的固定化及其基本性質(zhì)研究[J]. 生物化學(xué)雜志, 1993, 9(4)∶ 390-393.

[15] 賈月, 宮愛君, 邱麗娜, 等. 果膠酶分離純化及分析方法的研究進(jìn)展[J]. 工業(yè)微生物, 2005, 35(1)∶ 55-58.

[16] 曹建康, 姜微波, 趙玉梅. 果蔬采后生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京∶ 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2007.

[17] 王天龍, 仇宏偉, 陳海華, 等. 3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定果膠酶活力的條件研究[J].食品與機(jī)械, 2008, 24(3)∶ 96-104.

[18] 王小敏, 吳文龍, 閭連飛, 等. 分光光度計(jì)測(cè)定果膠酶活力的方法研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2007, 28(5)∶ 227-229.

[19] BRADFORD R M. A rapid and sensivive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem, 1976, 72(1/2)∶ 248-254.

[20] PRADE R A, ZOHAN D, AYOUBI P, et al. Pectins, petinases and plant-microbe interactions[J]. Biotechnol Genetic Eng Rev, 1999, 63(16)∶ 361-391.

[21] 趙亞華, 高向陽(yáng). 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程[M]. 廣州∶ 華南理工大學(xué)出版社, 2000∶ 2-5.

[22] 施巧琴. 酶工程[M]. 北京∶ 科學(xué)出版社, 2005∶ 142.

Optimization of Extraction Conditions for Polygalacturonase from Actinidia arguta

LIU Yue1,2，LI Shu-qian1,2，ZHANG Bo2，LIU Chang-jiang1，XIN Guang2,1*
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China；
2. Department of Chemistry, Anshan Normal University, Anshan 114007, China)

Actinidia argutawas used as the experimental material to explore the optimal extraction conditions and enzymatic activity analysis conditions of polygalacturonase (PG). The optimal extraction process parameters were explored by orthogonal tests through evaluating the effects of pH, ion concentration and DTT addition amount on extraction rate PG. The results indicated that the optimal extraction process condtions for PG were extraction pH of 5.5, acetate buffer concentration of 0.05 mol/L, NaCl concentration of 0.1 mol/L and DTT concentration of 1 mmol/L. The optimal enzymatic activity analysis conditions were reaction temperature of 40 ℃ and reaction time of 90 min.

Actinidia arguta；polygalacturonase (PG)；extraction；enzymatic activity analysis

TS255.2

A

1002-6630(2012)10-0115-04

2011-05-17

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(200903013)

劉月(1986—)，女，碩士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：lymoon2010@sina.com

*通信作者：辛廣(1966—)，男，教授，博士，主要從事生物技術(shù)研究。E-mail：xguang212@163.com