呂春茂，包 靜，孟憲軍，董文軒*，王新現

(1.沈陽農業(yè)大學園藝學院，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866)

HPD-700型大孔樹脂對野生越橘花色苷分離的研究

呂春茂1,2，包 靜2，孟憲軍2，董文軒1,*，王新現2

(1.沈陽農業(yè)大學園藝學院，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866)

采用柱層析法對野生越橘花色苷分離純化進行研究。結果表明：HPD-700型大孔樹脂對野生越橘花色苷的分離效果最佳，其適宜的分離條件為樣品液pH2.0、花色苷質量濃度0.75mg/mL、最大上樣量22BV、上樣流速0.5mL/min，樣品洗脫最佳乙醇體積分數60%、以流速1.5mL/min速度洗脫時、洗脫液量5BV為洗脫終點。該工藝生產的花色苷產品為紫黑色粉末，色價為62.40，回收率為86.20%。

野生越橘；HPD-700大孔樹脂；花色苷；吸附；解吸

越橘為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)植物，是多年生落葉或常綠小灌木樹種[1]，小型漿果，成熟果實藍紫色或藍黑色，又名藍漿果，果肉淡綠色，半透明，皮薄，有獨特的果香味[2]。越橘果實含有豐富的花色苷色素，花色苷類物質對人體健康非常有益，具有多種生物活性，如抗氧化及清除自由基、抗突變活性、抗炎癥及抗病毒作用[3]、增強關節(jié)和軟組織功能[4]、延緩腦神經衰老[5]，增強心臟功能和抗癌的獨特功效[6]，被聯合國糧農組織列為人類五大健康食品之一[7]。國內外對藍莓花色苷的研究主要集中在其生理功能方面，而對野生越橘花色苷純化方面研究較少[8]。由于越橘果實醇溶性花色苷提取物中含有膠質、淀粉、糖類、蛋白質、脂肪、有機酸堿、無機鹽、重金屬離子等，嚴重影響花色苷的應用范圍，因此花色苷的純化精制是天然花色苷生產加工的一個重要環(huán)節(jié)。

在花色苷分離純化方面主要有層析法(包括紙層析、薄層層析、柱層析)、毛細管電泳、高效液相色譜等方法。目前國內花色苷類色素的純化主要采用大孔樹脂柱層析法，大孔吸附樹脂是近10年發(fā)展起來的一類有機高分子聚合物吸附劑[9]。大孔樹脂吸附純化法以效率高、質量穩(wěn)定、成本低且操作簡單易行等特點而成為當前分離純化天然產物的主要方法[10-11]，已廣泛應用于天然色素的分離純化中[12]。本實驗采用柱層析的方法對野生越橘花色苷分離進行研究，篩選出適于越橘果中花色苷分離純化的樹脂類型，并對其吸附和解吸性能進行研究，以期為野生越橘花色苷在食品、藥品領域的開發(fā)利用提供一定的理論依據，為工業(yè)化生產花色苷提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生篤斯越橘(Vaccinium unliginosumL.)，采自長白山，冰袋冷藏運輸，－2 0℃冷凍貯藏。

無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉：均為分析純試劑；AB-8、X-5型大孔樹脂 天津南開大學化工廠產品；D101、HPD-100、HPD-400、HPD-600、HPD-700型大孔樹脂 河北滄州寶恩化工有限公司產品；S-8、NKA-9 上海寶曼生物科技有限公司；WD-6陰離子樹脂 安徽皖東化工有限公司。

UV-2100型可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；JY92-Ⅱ超聲波細胞破碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；pHS-25型酸度計 上海日島科學儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-IIIA 型循環(huán)水真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；SHA-C恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏儀器設備有限公司；玻璃層析柱(1.6cm×60cm) 上海青浦滬西儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 野生越橘花色苷吸收光譜的測定和工作曲線的制作

用pH3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制少量花色苷溶液，在400～750nm范圍內對其進行波長掃描，得到花色苷的吸收光譜圖。準確稱取越橘花色苷粉末，用pH3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液定容，根據比耳定律制作花色苷的工作曲線。

1.2.2 野生越橘花色苷粗提物制備

將貯藏于冰箱冷凍室的野生越橘果實用打漿機打成糊狀，冷凍過夜后進行真空冷凍干燥，收集干燥后粉末備用。取1g花色苷凍干粉用鹽酸體積分數1%、濃度60%的酸性乙醇溶液溶解，經超聲波細胞破碎機輔助處理，每次50mL、重復提取3次，收集粗提液后經旋轉蒸發(fā)得濃縮液，再經真空干燥得野生越橘花色苷粗提物粉末，呈紫黑色。

1.2.3 樹脂活化

對選定的樹脂進行預處理，先用無水乙醇浸泡24h→蒸餾水洗至中性→5%鹽酸浸泡12h→蒸餾水洗至中性→5%氫氧化鈉浸泡12h→蒸餾水洗至中性，備用。

1.2.4 最適樹脂的篩選

準確稱取1.00g野生越橘花色苷粉狀粗提物用提取液溶解，然后用pH3的檸檬酸﹣檸檬酸鈉緩沖液定容至1000mL，備用。分別稱取2.00g樹脂于250mL錐形瓶中，然后分別加入50mL已經配制好的野生越橘花色苷溶液，于30℃，110r/min，24h恒溫振蕩。取上清液在520nm最大吸收波長測量吸光度，按照公式測定各吸附率與解吸率。

其中：A0為原液的吸光度值；A1為樹脂吸附后上清液的吸光度值；A2為吸附飽和的樹脂經乙醇解吸后上清液的吸光度值。

通過對不同樹脂吸附率和解吸率的測定，篩選出最適樹脂。

1.2.5 洗脫劑的選擇

分別準確稱取已經吸附花色苷飽和的樹脂各0.40g，用蒸餾水沖洗一次，分別使用5mL甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯解吸花色苷，室溫靜止解吸12h，間歇搖動。測定解吸液的吸光度A。

1.2.6 不同流速的動態(tài)吸附曲線

準確稱取10mL預處理過的HPD-700型大孔樹脂裝柱，配制pH2.0質量濃度1mg/mL的越橘花色苷樣液，在室溫條件下進行吸附，分別設定0.5、1.0、1.5、2.0mL/min這4個不同的流速，每10mL接一個樣。測定不同流速對吸附的影響。

1.2.7 野生越橘花色苷濃度對動態(tài)吸附的影響

分別設定2.00、1.00、0.50、0.25mg/mL四個不同花色苷樣液質量濃度，調整其pH2，用預處理過的HPD-700大孔樹脂裝柱，采用1.0mL/min流速，在室溫條件下進行吸附，每10mL接一個樣。測定不同濃度對吸附的影響。

1.2.8 pH值對動態(tài)吸附的影響

準確稱取10mL預處理過的HPD-700型大孔樹脂裝柱，采用1.00mg/mL的樣液質量濃度，1.0mL/min流速，在室溫條件下進行吸附，分別設定1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0六個不同的pH值，每10mL接一個樣。測定不同pH值對吸附的影響。

1.2.9 不同洗脫劑流速的動態(tài)解吸曲線

準確稱取10mL已經吸附飽和的HPD-700型大孔樹脂裝柱，采用pH2.0體積分數70%乙醇溶液，在室溫條件下解吸，分別設定0.5、1.0、1.5、2.0mL/min四個流速，每10mL接一個樣。測定不同流速對解吸的影響。

1.2.10 洗脫劑體積分數對動態(tài)解吸的影響

準確稱取10mL已經吸附飽和的HPD-700型大孔樹脂裝柱，分別設定30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%八個洗脫劑體積分數，調整所有洗脫劑pH2.0，在1.0mL/min流速及室溫條件下進行解吸，每10mL接一個樣。測定洗脫劑體積分數對解吸的影響。1.2.11 pH值對動態(tài)解吸的影響

準確稱取10mL已經吸附飽和的HPD-700型大孔樹脂裝柱，采用體積分數50%乙醇溶液，在1.0mL/min流速及室溫條件下進行解吸，分別設定1.0、2.0、3.0、4.0、5.0這5個不同的pH值，每10mL接一個樣。測定pH值對解吸的影響。

1.2.12 越橘花色苷回收率和色價的測定

精確稱取自制的花色苷產品0.05g，用pH3.0的檸檬酸緩沖液定容至100mL容量瓶中，稀釋至一定倍數，在波長520nm處測定其吸光度，計算色價。

式中：A為吸光度：m為樣品的質量/g；r為測定吸光度時所吸取樣品的稀釋倍數[13]。

2 結果與分析

2.1 野生越橘花色苷吸收光譜

圖1 越橘果實花色苷色素緩沖液pH3.0全波長掃描圖Fig.1 Ultraviolet spectrum of bilberry extraction solution at pH 3.0

由圖1可知，越橘花色苷在pH3.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，在520nm處有一最大吸收峰，該吸收峰

是花色苷的特征峰465～560nm[15]。由圖2可知，在pH3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中吸光度與花色苷質量濃度成線性關系，標準曲線方程：A＝0.4311C＋0.0019，R2＝0.9972，式中，A為吸光度，C為花色苷質量濃度/(mg/mL)。

2.2 大孔樹脂的篩選

表1 不同大孔吸附樹脂對越橘花色苷靜態(tài)吸附和解吸的比較Table 1 Comparison of adsorption and desorption efficiencies using different resins

從表1可以看出，在30℃、110r/min、恒溫振蕩24h情況下，不同類型的樹脂對花色苷的吸附程度不同，吸附率最好的依次是HPD-100、HPD-400、AB-8、HPD-700，而解吸率最好的依次是NKA-9、HPD-600、X-5、HPD-700，綜合考慮吸附率和解吸率，后續(xù)實驗選用HPD-700型作為純化野生越橘花色苷的大孔吸附樹脂。

2.3 洗脫劑的選擇

圖2 不同洗脫劑對洗脫效果影響Fig.2 Effects of different elution agents on desorption efficiency

由圖2可知，不同洗脫劑對吸附飽和的HPD-700型大孔樹脂上花色苷的解吸能力依次為：乙醇＞丙酮＞甲醇＞乙酸乙酯，且差異顯著，因此選用乙醇作為HPD-700型大孔吸附樹脂的洗脫劑。

2.4 動態(tài)吸附

2.4.1 不同流速的動態(tài)吸附曲線

圖3 不同流速的動態(tài)吸附曲線Fig.3 Dynamic adsorption curves at the conditions of absorption rates

在0.5、1.0、1.5、2.0mL/min這4個不同的流速情況下，HPD-700型大孔樹脂對1mg/mL越橘花色苷樣液pH2.0的吸附曲線見圖3。隨著上樣液體積的增加，流出液中花色苷含量逐漸增加。當流出液中花色苷吸光度達到上樣液花色苷吸光度的1/10時，被認為已經出現泄漏[16]。由圖3可知，上樣液體積達到220mL時出現泄漏。隨流出液體積的增大，其花色苷的吸光度也逐漸增加，樹脂對花色苷的吸附百分比逐漸下降。上樣液流速低，花色苷的泄漏率也比較低。本實驗上樣流速0.5mL/min時HPD-700型樹脂對花色苷有較好的吸收。

2.4.2 越橘花色苷質量對動態(tài)吸附的影響

圖4 花色苷質量濃度對動態(tài)吸附的影響Fig.4 Effect of anthocyanins concentration on adsorption efficiency

由圖4可見，HPD-700型大孔吸附樹脂對野生越橘花色苷的吸附能力隨著花色苷質量濃度的降低而增加，但花色苷質量濃度為1.00mg/mL時與質量濃度0.50、0.25mg/mL的差異不大。根據實際效率和經濟效益考慮，選擇1.00mg/mL作為動態(tài)吸附中花色苷質量濃度。

2.4.3 pH值對動態(tài)吸附的影響

由圖5可知，不同pH值對HPD-700型大孔吸附樹脂動態(tài)吸附的影響并不顯著，但是對花色苷的顯色有很大的影響，在pH小于3時影響最小，而pH值過低又會影響花色苷的結構，故本實驗選擇pH2。

圖5 pH值對動態(tài)吸附的影響Fig.5 Effect of pH on adsorption efficiency

2.4.4 正交試驗結果

根據單因素結果設計三因素三水平正交試驗。正交試驗因素及水平見表2，正交試驗設計及結果見表3。可以看出，各因素對HPD-700型大孔吸附樹脂吸附率影響的主次順序是B＞A＞C，即花色苷質量濃度＞流速＞pH值。確定的最佳提取條件為A1B1C2，即流速0.5mL/min、花色苷質量濃度0.75mg/mL、pH2.0。

表2 HPD-700型大孔吸附樹脂動態(tài)吸附L9(33)正交試驗因素及水平Table 2 Factors and levels of orthogonal tests for optimizing the absorption of HPD-700

表3 HPD-700型大孔吸附樹脂動態(tài)吸附L9(33)正交試驗設計及結果Table 3 Design and results of orthogonal tests for optimizing the absorption of HPD-700

確定最佳吸附條件為流速0.5mL/min、花色苷質量濃度0.75mg/mL、pH2.0。在此條件下對HPD-700 型大孔吸附樹脂的吸附率進行測定，求得吸附率為97.12%，說明吸附工藝得到優(yōu)化。

2.5 動態(tài)解吸

2.5.1 不同流速的動態(tài)解吸曲線

圖6 不同流速的動態(tài)解吸曲線Fig.6 Dynamic desorption curves at the conditions of different desorption rates

由圖6不同流速的動態(tài)解吸曲線可以看出，流速為1.0mL/min時具有最大的解吸能力；且四種流速處理中，3BV的70%乙醇均基本可將吸附在樹脂上的花色苷洗脫下來，當洗脫液達到5BV時，已解吸下來超過99%的花色苷。曲線的出峰快，洗脫峰集中，無明顯拖尾現象。2.5.2 洗脫劑體積分數對動態(tài)解吸的影響

圖7 乙醇體積分數對動態(tài)解吸的影響Fig.7 Effect of ethanol concentration on desorption efficiency

由圖7可知，不同洗脫劑體積分數對花色苷的解吸能力影響較大，當乙醇體積分數50%時，具有最大的解吸能力。

2.5.3 pH值對動態(tài)解吸的影響

圖8 pH值對動態(tài)解吸的影響Fig.8 Effect of pH on desorption efficiency

由圖8可知，在洗脫液達到3個柱體積時，絕大部分的花色苷被解吸下來，且pH2時具有最大的解吸能力。

2.5.4 HPD-700型大孔吸附樹脂解吸正交試驗

根據單因素結果設計三因素三水平正交試驗。正交試驗因素及水平見表4，試驗設計及結果見表5。由表5可以看出，通過極差的大小確定各因素對HPD-700型大孔吸附樹脂解吸率影響的主次順序是C＞B＞A，即pH值＞乙醇體積分數＞流速。確定的最佳提取條件為A3B3C1，即流速1.5mL/min、乙醇體積分數為60%、pH1.0。在此條件下對HPD-700 型大孔吸附樹脂的解吸率進行測定，求得解吸率為80.37%，說明解吸工藝得到優(yōu)化。

表4 HPD-700型大孔吸附樹脂解吸L9(33)正交試驗因素及水平Table 4 Factors and levels of orthogonal tests for optimizing the desorption of HPD-700

表5 HPD-700型大孔吸附樹脂解吸L9(33)正交試驗設計及結果Table 5 Design and results of orthogonal tests for optimizing the desorption of HPD-700

2.6 野生越橘花色苷色價和回收率的測定

純化后的野生越橘花色苷為紫黑色粉末，其色價為64.20，回收率為86.20%。

3 結 論

通過對10種大孔樹脂的靜態(tài)吸附研究，HPD-700型是一種較好的純化野生越橘花色苷的大孔樹脂；野生越橘花色苷在HPD-700型上的吸附平衡條件為22BV，解吸平衡條件為5BV，在上樣流速0.5mL/min，花色苷質量濃度0.75mg/mL，pH2.0的條件下吸附效果最好；采用pH1.0體積分數60%的乙醇溶液，在流速1.5mL/min的條件下洗脫效果好。該工藝生產的花色苷產品為紫黑色粉末，色價為64.20，回收率為86.20%。

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Separation of Anthocyanins from Wild Bilberry by HPD-700 Macroporous Resin

LU.. Chun-mao1,2，BAO Jing2，MENG Xian-jun2，DONG Wen-xuan1,*，WANG Xin-xian2(1. College of Horticultural Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China；
2. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

In this study, the separation methods of anthocyanins from wild bilberry were investigated. The results showed that the macroporous resin HPD-7 was the optimal absorption material. The optimum conditions of adsorption and desorption were pH 2.0, anthocyanins concentration of 0.75 mg/mL, sample loading volume of 22 BV (resin bed volume) the adsorption speed of 0.5 mL/min, the 60% ethanol volume as the eluent of 5 BV, and the desorption speed of 1.5 mL/min. Under the optimal separation and purification conditions, a purplish dark powder with color value of 62.40 was achieved at the recovery rate of 86.20%.

wild bilberry；HPD-700 macroporous resin；anthocyanins；adsorption；desorption

TS255.1

A

1002-6630(2012)10-0078-06

2011-07-01

沈陽農業(yè)大學博士后基金項目；沈陽市青年人才基金項目(1081240-1-02)

呂春茂(1970—)，男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：Bt_lcm@126.com

*通信作者：董文軒(1963—)，男，教授，博士，研究方向為果樹種子資源。E-mail：wxdong63@126.com