戴佳錕，李 燕，馬 齊，關(guān)正君，張 超，張艷婷，趙榮榮，尉亞輝,*

(1.陜西省科學(xué)院酶工程研究所，陜西 西安 710600；2.陜西省酶工程技術(shù)中心，陜西 西安 710600；3.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710069；4.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

從畢赤酵母中提取外源重組蛋白的超聲破碎條件及優(yōu)化

戴佳錕1,2,3，李 燕4，馬 齊1,2，關(guān)正君3，張 超3，張艷婷3，趙榮榮3，尉亞輝3,*

(1.陜西省科學(xué)院酶工程研究所，陜西 西安 710600；2.陜西省酶工程技術(shù)中心，陜西 西安 710600；3.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710069；4.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

建立適用于從畢赤酵母菌中提取外源重組蛋白的超聲破碎方法。采用Western Blotting免疫印記技術(shù)檢測(cè)從畢赤酵母菌中提取的外源人脂聯(lián)素蛋白活性，并以外源人脂聯(lián)素蛋白活性作為考察指標(biāo)，采用單因素和L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)超聲破碎條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：在外源人脂聯(lián)素蛋白活性最高的情況下，超聲破碎條件為超聲破碎功率450W、時(shí)間25min、時(shí)間間隔(工作時(shí)間:間歇時(shí)間)10:10(s/s)，此時(shí)細(xì)胞破碎率為(67.8±2.1)%。若在超聲破碎時(shí)添加1mmol/L PMSF，雖對(duì)細(xì)胞破碎率并無(wú)顯著影響，但外源人脂聯(lián)素蛋白活性將會(huì)明顯增高。

畢赤酵母；超聲破碎法；人脂聯(lián)素蛋白；Western Blotting免疫印記技術(shù)

酵母菌已廣泛應(yīng)用于食品、飼料以及發(fā)酵行業(yè)[1-4]。其不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且也是基因工程技術(shù)應(yīng)用中十分重要的宿主菌[5]。酵母菌所表達(dá)的外源蛋白經(jīng)過(guò)糖基化、?；约疤砑佣蜴I等加工修飾后，結(jié)構(gòu)和功能均與原蛋白相差無(wú)幾。但是，酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁厚且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質(zhì)等形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)組成[6-7]，十分不利于外源蛋白提取。因此，建立高效、實(shí)用的酵母細(xì)胞破壁方法尤為重要。

目前，雖已有多種方法應(yīng)用于酵母細(xì)胞破碎，但仍存在不少弊端。例如：玻璃珠法操作復(fù)雜，液體損失大；酶裂解法成本高且易造成產(chǎn)物抑制；化學(xué)法作用時(shí)間長(zhǎng)、效率低，所用試劑毒性較大[8]。而超聲破碎技術(shù)，作為一種設(shè)備需求低、使用便捷、安全性好的細(xì)胞破碎方法，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于裂解原核[9-10]以及真核細(xì)胞[11]。然而，在超聲破碎法的推廣使用中，研究人員一直致力于如何提高細(xì)胞破碎率，增加外源蛋白得率，卻缺乏在提高細(xì)胞破碎率的同時(shí)，對(duì)外源蛋白損壞、降解的探索。本研究采用表達(dá)人脂聯(lián)素蛋白的重組畢赤酵母菌株做為實(shí)驗(yàn)材料[12]，以保證外源蛋白高活性為首要指標(biāo)，探尋適于從畢赤酵母GS115、乃至其他酵母菌株中提取外源重組蛋白的超聲破碎方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

經(jīng)誘導(dǎo)可表達(dá)人脂聯(lián)素蛋白的畢赤酵母GS115菌株(簡(jiǎn)寫為GS115-AP)，由西北大學(xué)西部資源與現(xiàn)代生物技術(shù)省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

人脂聯(lián)素單克隆抗體(一抗) 美國(guó)ALEXIS公司；單克隆抗體IgG(二抗)、Western Blotting化學(xué)發(fā)光底物美國(guó)Pierce公司；PMSF、蝸牛酶 美國(guó)Sigma公司；PVDF雜交膜 美國(guó)Millipore公司；BMGY、BMMY液體培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)室自制；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

BMGY液體培養(yǎng)基：含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%酵母浸出物、2%蛋白胨、1.34% YNB、4×10-7生物素、體積分?jǐn)?shù)1%甘油、0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液，pH6.0；BMMY培養(yǎng)基：含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的酵母浸出物、2%蛋白胨、1.34% YNB、4×10-7生物素，體積分?jǐn)?shù)0.5%甲醇，0.1mol/L磷酸鉀緩沖液，pH6.0；裂解液：50mmol/L NaH2PO4，1mmol/L EDTA-2Na，體積分?jǐn)?shù)5%甘油，pH7.4。

1.2 儀器與設(shè)備

S-250D超聲破碎儀 上海生析超聲儀器有限公司；5415D低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Western Blotting實(shí)驗(yàn)設(shè)備 北京六一公司；BX50-F4顯微鏡 日本Olympus公司；GelDoc XR凝膠電泳成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的培養(yǎng)和收集

挑取GS115-AP菌株單克隆至5mL BMGY液體培養(yǎng)基中，于28℃、250r/min振蕩培養(yǎng)18h。吸取0.5mL菌液再次接種于50mL新鮮BMGY液體培養(yǎng)基中，同條件培養(yǎng)至OD600約為2.0。將菌液在6000r/min離心5min，然后收集菌體，重懸于100mL BMMY培養(yǎng)基中同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，并且每24h向培養(yǎng)液中補(bǔ)充0.5mL甲醇。誘導(dǎo)表達(dá)96h后，離心收集菌體，用蒸餾水洗3遍后分成數(shù)份，每份0.5g。

1.3.2 畢赤酵母細(xì)胞的超聲破碎

將1.3.1節(jié)制備的1份酵母菌體轉(zhuǎn)入50mL離心管中，加入15mL預(yù)冷的裂解液，振蕩混勻后，冰浴20min。將超聲破碎儀探頭置于離心管液面下約1cm處，在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎。

1.3.3 破碎率檢測(cè)

將超聲破碎前后的細(xì)胞懸液分別稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后，在顯微鏡下觀察，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)完整形態(tài)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過(guò)計(jì)算得到細(xì)胞破碎率，每組統(tǒng)計(jì)3次，取平均值。

式中：A1為破碎前的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果；A2為破碎后的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。

1.3.4 外源人脂聯(lián)素蛋白質(zhì)活性檢測(cè)

超聲破碎結(jié)束后，以12000r/min離心裂解懸液10min。吸取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后經(jīng)轉(zhuǎn)膜、一抗(濃度1:5000)和二抗(1:2000)孵育后，在暗室中由化學(xué)發(fā)光底物顯色并用感光膠片記錄保存[13]。膠片成像后，用Quantity One凝膠成像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，以測(cè)得的灰度密度值數(shù)值大小直接反映外源人脂聯(lián)素蛋白活性高低(此數(shù)值只用于反映同1張圖片上各個(gè)條帶之間的強(qiáng)弱關(guān)系，不作為不同圖片上條帶之間對(duì)比的依據(jù))。

2 結(jié)果與分析

2.1 破碎功率的影響

細(xì)胞懸液經(jīng)冰浴處理后，分別在破碎功率1 8 0、270、360、450 、540、630W的條件下超聲破碎，破碎時(shí)間20min，時(shí)間間隔(工作時(shí)間:間歇時(shí)間)為10:8(s/s)。結(jié)果如圖1所示，破碎率隨著破碎功率的增加而相應(yīng)增高，在最大功率630W時(shí)達(dá)到(72.3±1.9)%。而外源蛋白活性(以灰度密度值數(shù)值大小表示)卻與之不同。當(dāng)破碎功率增加時(shí)，外源蛋白活性先是不斷升高，在450W時(shí)達(dá)到最大，而隨后開(kāi)始逐漸下降。為了保證外源蛋白活性最大，將超聲破碎功率選定為450W左右較為適宜。

圖1 超聲功率對(duì)破碎率及外源蛋白活性的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on breaking rate of cell walls and protein activity

2.2 破碎時(shí)間的影響

選定破碎功率450W、時(shí)間間隔10:8(s/s)，然后分別超聲破碎15、20、25、30、35、40min并檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，破碎率與破碎時(shí)間呈正相關(guān)，并且在25min之前破碎率增加較為顯著，之后則趨于緩慢。外源蛋白活性則隨著破碎時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，在30min處到達(dá)峰值后便開(kāi)始迅速降低。因此，選定破碎時(shí)間為30min左右較為適宜。

圖2 破碎時(shí)間對(duì)破碎率及外源蛋白活性的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on breaking rate of cell walls and protein activity

2.3 破碎時(shí)間間隔的影響

在超聲破碎過(guò)程中，時(shí)間間隔是一個(gè)重要指標(biāo)：時(shí)間間隔的變化直接影響著細(xì)胞破碎率，而且，時(shí)間間隔的不同還會(huì)引起超聲過(guò)程中熱效應(yīng)和空化效應(yīng)的改變，制約著外源蛋白活性。本試驗(yàn)將破碎功率定為450W，在時(shí)間間隔分別5:10、8:10、10:10、10:8(s/s)和10:5(s/s)的條件下超聲破碎30min。從圖3可以看出，工作時(shí)間在時(shí)間間隔中所占比值越高，細(xì)胞破碎率越高。當(dāng)時(shí)間間隔為10:5(s/s)時(shí)，細(xì)胞破碎率達(dá)到(91.2±2.1)%。而外源蛋白活性則先增后減，在時(shí)間間隔為10:10(s/s)時(shí)最高。因此，選定10:10(s/s)時(shí)間間隔較為適宜。

圖3 時(shí)間間隔對(duì)破碎率及外源蛋白活性的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment interval on breaking rate of cell walls and protein activity

本試驗(yàn)結(jié)果與李永霞等[11]研究的游離氨基酸總量在不同超聲破碎條件下變化的情況一致?？傮w上，破碎功率、破碎時(shí)間以及破碎時(shí)間間隔的變化均可歸結(jié)為破碎強(qiáng)度的變化。在破碎強(qiáng)度較低時(shí)，其適當(dāng)?shù)脑黾涌梢蕴岣呒?xì)胞破碎率，從而增加裂解懸液中蛋白質(zhì)含量，最終促使外源蛋白總體活性升高。而當(dāng)破碎強(qiáng)度達(dá)到一定程度后，雖然破碎率仍有大幅增加，但是過(guò)大的破碎強(qiáng)度加劇了破碎過(guò)程中的熱效應(yīng)和空化效應(yīng)，致使蛋白質(zhì)損傷劇增，最終導(dǎo)致外源蛋白總體活性降低[14-15]。

2.4 超聲破碎條件的正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)影響外源人脂聯(lián)素蛋白活性的超聲功率、超聲時(shí)間和超聲時(shí)間間隔進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。在正交試驗(yàn)中，以外源蛋白活性，即測(cè)得的密度灰度值作為優(yōu)化指標(biāo)，結(jié)果如表2所示。

表2 超聲破碎工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal tests

從表2可知，對(duì)外源人脂聯(lián)素蛋白活性影響因素主次順序?yàn)锽＞C＞A；從畢赤酵母中提取外源人脂聯(lián)素蛋白的最佳工藝條件為A2B1C2，即超聲功率450W、超聲時(shí)間25min、超聲時(shí)間間隔10:10(s/s)。由表3可知，超聲時(shí)間是影響外源人脂聯(lián)素蛋白活性的顯著性因素。

表3 正交試驗(yàn)方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal tests

2.5 PMSF對(duì)外源蛋白活性的影響

PMSF是一種廣泛使用的蛋白酶抑制劑，可以有效抑制蛋白水解酶和巰基蛋白酶活性，從而減少外源蛋白的降解和損傷。將獲得的菌體重懸于15mL預(yù)冷的裂解液中，冰浴20min，然后加入PMSF使之終濃度達(dá)到1mmol/L?？瞻捉M與實(shí)驗(yàn)組均在破碎功率450W、時(shí)間間隔10:10(s/s)的條件下超聲破碎25min。結(jié)果如圖4所示，PMSF添加組與空白組的細(xì)胞破碎率并無(wú)顯著差異，分別為(67.1±2.5)%和(67.8±2.1)%。然而，PMSF添加組的外源蛋白活性卻明顯高于空白組。這說(shuō)明在細(xì)胞超聲破碎過(guò)程中，PMSF僅僅具有蛋白酶抑制劑的作用，其可以對(duì)外源蛋白起到較好的保護(hù)，但對(duì)細(xì)胞破碎率卻無(wú)輔助功效。

圖 4 PMSF對(duì)破碎率及外源蛋白活性的影響Fig.4 Effect of PMSF addition on breaking rate of cell walls and protein activity

2.6 超聲破碎法與玻璃珠法和酶裂解法的對(duì)比

用優(yōu)化后的超聲破碎法與玻璃珠法[13]和酶裂解法[16]分別處理酵母細(xì)胞，將細(xì)胞破碎率進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，超聲破碎法和玻璃珠法的破碎率近似，均優(yōu)于酶裂解法。

表4 不同破碎方法所得的細(xì)胞破碎率Table 4 Breaking rate of cell walls by using different methods

3 結(jié) 論

超聲破碎法技術(shù)成熟，已廣泛應(yīng)用于破碎各種細(xì)胞。以往的研究大多著重于追求高破碎率以獲得盡可能多的外源蛋白，卻忽略了外源蛋白活性的高低。本實(shí)驗(yàn)將外源蛋白活性作為首要指標(biāo)，探尋在外源蛋白活性最高時(shí)的超聲破碎條件。由畢赤酵母GS115細(xì)胞的超聲破碎結(jié)果可以得出，在破碎功率450W、時(shí)間間隔10:10(s/s)條件下破碎25min時(shí)，外源人脂聯(lián)素蛋白所受損傷最小，活性最高。

在裂解液中添加適量的PMSF(1mmol/L)可以有效地提高外源蛋白質(zhì)活性，但對(duì)細(xì)胞破碎率幾乎無(wú)影響，PMSF添加與未添加組的細(xì)胞破碎率分別為(67.1±2.5)%和(67.8±2.1)%。

優(yōu)化得到的超聲破碎法與傳統(tǒng)的玻璃珠法和酶裂解法相比，操作簡(jiǎn)便、成本低廉。在推廣使用中，只需在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行少許調(diào)整和改進(jìn)，便可廣泛應(yīng)用于破碎其他酵母細(xì)胞或提取不同種類的外源蛋白。

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Optimization of Ultrasonic Treatment for Recovery of Recombinant Protein fromPichia pastoris

DAI Jia-kun1,2,3，LI Yan4，MA Qi1,2，GUAN Zheng-jun3，ZHANG Chao3，ZHANG Yan-ting3，ZHAO Rong-rong3，WEI Ya-hui3,*
(1. Institute of Enzyme Engineering, Shaanxi Academy of Sciences, Xi，an 710600, China；2. Enzyme Engineering Technology Center of Shaanxi, Xi，an 710600, China；3. Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, College of Life Science, Northwest University, Xi，an 710069, China；4. Shaanxi Provincial Institute of Microbiology, Xi，an 710043, China)

In order to establish an appropriate ultrasonic treatment method for the recovery of recombinant protein fromPichia pastoris, the activity of human-adiponectin recombinant protein was evaluated by Western Blotting analysis. A L9(33) orthogonal array design based on single-factor tests was employed to optimize the conditions for ultrasonic treatment. The results showed that the optimal ultrasonic treatment conditions were ultrasonic power of 450 W, ultrasonic treatment time of 25 min and ultrasonic treatment interval of 10 s. Under the optimal ultrasonic treatment conditions, the breaking rate of cell walls was (67.8 ± 2.1)%.The activity of human-adiponectin recombinant protein could be significantly improved by adding 1 mmol/L of PMSF although the addition of PMSF had no effect on breaking rate of cell walls.

Pichia pastoris；ultrasonication；human-adiponectin protein；Western Blotting analysis

Q819

A

1002-6630(2012)10-0057-04

2011-05-18

陜西省科學(xué)院科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011K-17)；西北大學(xué)自主創(chuàng)新類項(xiàng)目(10YZZ36)

戴佳錕(1984—)，男，初級(jí)研究員，碩士，研究方向?yàn)榛蚬こ碳凹?xì)胞工程制藥。E-mail：djkxa@163.com

*通信作者：尉亞輝(1960—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)榛蚬こ碳凹?xì)胞工程制藥。E-mail：weiyahui@nwu.edu.cn