克熱木江·吐爾遜江，努爾阿米娜·阿布都肉蘇，吐爾遜娜依·迪力夏提，阿不都拉·阿巴斯*

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

新疆野蘋果果實中總黃酮的提取工藝

克熱木江·吐爾遜江，努爾阿米娜·阿布都肉蘇，吐爾遜娜依·迪力夏提，阿不都拉·阿巴斯*

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

以新疆野蘋果果實為原料，對新疆野蘋果果實中的總黃酮提取工藝進行研究，采用單因素試驗法對總黃酮提取率的主要因素進行分析，利用正交試驗優(yōu)化最佳工藝條件，并在最佳提取條件下對3種栽培蘋果(二曲子、紅元帥、檳子)進行總黃酮的提取，并與野蘋果的總黃酮含量進行對照。結(jié)果表明：新疆野蘋果果實中提取總黃酮的最佳條件為乙醇體積分數(shù)55%、提取溫度50℃、料液比1:45(g/mL)、提取時間2h，在最佳條件下熱風(fēng)干燥的野蘋果果實中總黃酮的提取率為6.78%，冷凍干燥的野蘋果、紅元帥、二曲子和檳子的總黃酮提取率分別為13.61%、2.01%、1.45%和6.69%。

新疆野蘋果；總黃酮；冷凍干燥

野蘋果(Malus sieversii(Ldb.) Roem)又名塞威士蘋果，喬木，是我國特有種[1]，生于山間臺地、陰坡和半陰坡，海拔1100～1400m，常組成大面積群林。主要分布在伊犁谷地和準(zhǔn)噶爾西部巴爾魯克山。其果實形狀有扁圓形、近圓形、圓形和圓錐形等，果皮顏色有綠、黃、橘黃、粉紅、紅和深紅等，具有栽培蘋果的典型特征[2]。研究表明，與富士、金帥和紅星品種相比，新疆野蘋果在礦物質(zhì)元素、3種糖(果糖、葡萄糖、蔗糖)及蘋果酸含量方面表現(xiàn)出很好的營養(yǎng)優(yōu)勢[3]。

黃酮類化合物作為一種功能成分，具有許多有益的生理效應(yīng)和藥理作用，越來越引起人們的重視[4-5]。本研究利用乙醇提取法提取新疆野蘋果果實的總黃酮，并優(yōu)化提取工藝，為新疆野蘋果在保健食品方面的開發(fā)利用提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆野蘋果果實于2010年9月采于新疆伊犁哈薩克自治州霍城縣大西溝山坡。

二曲子、紅元帥、檳子蘋果均從大西溝鄉(xiāng)農(nóng)民果園里采集。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇 天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；乙醚 江蘇省南通友邦機械有限公司；NaNO2、NaOH 天津市化學(xué)試劑三廠；Al(NO3)3·9H2O 天津市盛淼精細化工有限公司。上述試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

S24可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵、HH-S型水浴鍋 鞏義市予華儀器廠；電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；WH-3微型旋渦混合儀 上海瀘西分析儀器廠；DHG-9141A型電熱恒溫干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；MDF-U53V超低溫冰箱 Sanyo (日本)電子有限責(zé)任公司；RZ2真空泵、Alpha1-2 LD冷凍干燥器 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣粉的制備

對新疆野蘋果果實采用熱風(fēng)干燥方法制備樣粉：取一部分新疆野蘋果果實置于60℃干燥箱進行烘干，粉碎過篩(60目)，經(jīng)石油醚脫脂脫色后烘干至無殘留，得到蘋果果實樣粉備用。

1.3.2 總黃酮的提取

精密稱取2.0g脫脂后的果實粉末，置于250mL圓底燒瓶中，加適量相應(yīng)體積分數(shù)(4 0%、5 0%、6 0%、70%、80%)乙醇在混合儀中混合約20s，至相應(yīng)的料液比[(1:20、1:30、1:40、1:50、1:60(g/mL)]，在相應(yīng)溫度(20、40、60、80、100℃)的水浴條件下提取相應(yīng)時間(1、1.5、2、2.5、3h)后，過濾，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在55℃條件下濃縮，將濃縮液加體積分數(shù)60%的乙醇溶液定容至50mL備用。

1.3.3 總黃酮含量的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法[6]測總黃酮含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取在120干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁對照品5mg，置于50mL容量瓶中，加適量體積分數(shù)60%乙醇溶液，在溫水(40)中溶解，放冷后加60%乙醇溶液定容為質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

精確量取上述儲備標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分別置于25mL容量瓶中，加入質(zhì)量分數(shù)5%的亞硝酸鈉0.8mL，搖勻，放置6min，后加入質(zhì)量分數(shù)10%的硝酸鋁溶液0.8mL，搖勻，放置 6min，再加入質(zhì)量分數(shù)4%的NaOH溶液10mL，用體積分數(shù)60%乙醇溶液定容，搖勻，放置12min后，在510nm波長處測定其吸光度。以吸光度(y)為縱坐標(biāo)、溶液濃度(x)為橫坐標(biāo)作圖，得回歸方程[7]：y＝5.6071x－0.0002(R2＝0.9997)。

1.3.4 總黃酮提取率的計算[8]

將1.3.2節(jié)提及的提取液稀釋至相應(yīng)倍數(shù)后如1.3.3節(jié)方法，自“加入質(zhì)量分數(shù)5%的亞硝酸鈉溶液 0.8mL”開始操作，測定吸光度，代入回歸方程，計算出相應(yīng)的黃酮質(zhì)量濃度。按照下式計算黃酮的提取率：

1.3.5 冷凍干燥各蘋果品種與熱風(fēng)干燥新疆野蘋果果實的黃酮提取率的比較

將新疆野蘋果、二曲子、紅元帥以及檳子先在－86℃冷凍6h后，在－54℃、真空度70Pa條件下進行真空冷凍干燥24h，后粉碎過篩(60目)，經(jīng)石油醚脫脂脫色后烘干至無殘留，得到蘋果果實樣粉備用，在最優(yōu)條件下按照1.3.2節(jié)方法分別提取此4種果實的黃酮，并與熱風(fēng)干燥后新疆野蘋果果實的黃酮提取率進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溫度對提取率的影響

在乙醇體積分數(shù)60%、料液比1:40(g/mL)、提取時間2h條件下，不同提取溫度對黃酮提取率的影響如圖1所示。由圖1可知，在溫度為60℃時提取率最高。溫度增高，提取率反而下降。原因可能是在溫度過高的情況下，可溶性蛋白質(zhì)溶出變性，導(dǎo)致溶液黏度增大，影響細胞的破裂。從而阻礙了黃酮類物質(zhì)的溶出，因此降低了黃酮的提取率[9]。

圖1 提取溫度對提取率的影響Fig. 1 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids

2.2 提取時間對提取率的影響

圖2 提取時間對提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids

圖2顯示了提取溫度為60℃時不同提取時間對野蘋果果實中黃酮類物質(zhì)的提取率的影響，其他試驗條件同

2.1節(jié)。由圖可知，當(dāng)提取時間為2h時，提取效果最好。時間過短，黃酮類化合物還未充分溶出，但當(dāng)時間繼續(xù)延長時，因為黃酮逐漸被氧化而導(dǎo)致總黃酮提取率的降低。

2.3 料液比對提取率的影響

圖3 料液比對提取率的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids

圖3顯示提取時間為2h的條件下，不同料液比對新疆野蘋果中黃酮提取率的影響，其他試驗條件如2.2節(jié)。結(jié)果表明：料液比為1:40(g/mL)時的提取效果達到最佳。當(dāng)料液比過小時，樣品里的總黃酮沒能充分地溶解出來；料液比過高，導(dǎo)致有些對總黃酮不利的成分的溶解，干擾黃酮的提取。

2.4 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響

圖4 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids

圖4顯示了在料液比為1:40(g/mL)條件下，不同乙醇體積分數(shù)對新疆野蘋果中黃酮的提取率的影響，其他試驗條件同2.3節(jié)。由圖4可知，隨著乙醇體積分數(shù)的提高，黃酮類物質(zhì)的提取率也增加，在乙醇體積分數(shù)為60%時出現(xiàn)峰值。在乙醇體積分數(shù)大于60%時，提取率有所下降，這可能由于乙醇體積分數(shù)高會在細胞壁上產(chǎn)生保護膜，阻止細胞內(nèi)黃酮的溶解出來。

2.5 總黃酮提取工藝優(yōu)化

由以上單因素試驗可知，總黃酮的提取溫度、料液比、提取時間、乙醇體積分數(shù)等多個因素對黃酮類的提取率均具有很大的影響。為了對總黃酮提取工藝條件優(yōu)化，選擇L9(34)正交試驗[10]，其因素水平見表1。正交試驗結(jié)果和方差分析結(jié)果見表2、3。

表1 總黃酮提取工藝正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

表2 總黃酮提取工藝L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal tests

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis

從表2、3可以看出，各因素對提取效果影響的大小順序是：料液比對提取效果的影響最大，其次為乙醇體積分數(shù)和提取溫度，提取時間影響最小。料液比和乙醇體積分數(shù)對提取的影響達到顯著水平，最優(yōu)提取方案為A1B3C2D1，即提取溫度50℃、料液比1:45(g/mL)、提取時間2h、乙醇體積分數(shù)55%，在此參數(shù)組合條件下，做了3次重復(fù)實驗，野蘋果果實中黃酮類化合物提取率平均為6.78%，高于正交試驗中的總黃酮提取率，證明了實驗的可靠性[11]。

2.6 冷凍干燥各蘋果品種與熱風(fēng)干燥新疆野蘋果果實的總黃酮提取率的比較

表4 5種蘋果粉體的部分特性Table 4 Properties of five apple powders

表4表明，4種蘋果(新疆野蘋果、二曲子、紅元帥、檳子)粉末中，烘干和冷凍干燥的野蘋果的總黃酮含量、粉體顏色及品味其他品種有明顯的差別：冷凍干燥的野蘋果果實黃酮提取率最高，檳子的總黃酮提取率次之，為6.69%，含量最低的是二曲子1.45%。但熱風(fēng)干燥的野蘋果總黃酮提取率遠遠大于冷凍干燥的其他品種蘋果的總黃酮含量。干燥方法的不同決定黃酮含量的高低。冷凍干燥的時間短，有效成分損失小，但是一次能干燥的樣品的量少，耗電量較高。冷凍干燥后的樣品可以保留新鮮食品的色、香、味及營養(yǎng)成分，比其他干燥方法生產(chǎn)的食品更接近新鮮食品，避免了一般干燥方法中因物料內(nèi)部水分向表面遷移而將無機鹽和營養(yǎng)攜帶到物料表面而造成表面硬化和營養(yǎng)損失等現(xiàn)象[12-13]，而烘干的樣品在干燥過程中會流失部分有效成分。

3 結(jié) 論

本實驗結(jié)果表明，影響總黃酮提取率的因素主次順序為料液比、乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間。最佳的參數(shù)組合為提取溫度50℃、料液比1:45(g/mL)、提取時間2h、乙醇體積分數(shù)55%，在此條件下，烘干的新疆野蘋果果實中黃酮類物質(zhì)的提取率達到6.78%，冷凍干燥的野蘋果的總黃酮含量為13.61%，相當(dāng)于烘干野蘋果中總黃酮含量的2.01倍。新疆野蘋果中的黃酮類化合物明顯高于其他3種栽培蘋果，并且其在礦物質(zhì)元素、糖類和蘋果酸等物質(zhì)含量方面優(yōu)于其他品種，因此新疆野蘋果能為藥學(xué)，保健食品領(lǐng)域提供很好的綠色植物資源。

[1] 郭仲軍, 劉麗艷, 張煒銀, 等. 新疆野蘋果資源現(xiàn)狀分析及前景展望[C]//中國生物多樣性保護與研究進展. Ⅶ: 第七屆全國生物多樣性保護與持續(xù)利用研討會論文集. 北京: 氣象出版社, 2006: 54-61.

[2] 安爭夕, 周桂玲, 楊昌友, 等. 新疆植物志[M]. 烏魯木齊: 新疆科技衛(wèi)生出版社, 1995, 2(2): 292-295.

[3] 張小燕, 陳學(xué)森, 彭勇, 等. 新疆野蘋果礦質(zhì)元素與糖酸組分的遺傳多樣性[J]. 園藝學(xué)報, 2008, 35(2): 277-280.

[4] 陳乃富, 張莉, 夏冠軍. 金櫻子黃酮類化合物提取條件研究[J]. 中國林副特產(chǎn), 2006(4): 1-4.

[5] 張梅. 旱蓮草中黃酮類成分的免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 中草藥, 1997, 28(10):615.

[6] 董彩文, 梁少華, 湯風(fēng)雨, 等. 蘋果渣中總黃酮的提取及其抑菌活性研究[J]. 安微農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(27): 11931; 11662.

[7] 宮玉婷, 王鈺, 阿不都拉·阿巴斯. 梓樹果實中黃酮類化合物提取工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(4): 193-195.

[8] 庫爾班尼沙·買提卡思木. 苘麻黃酮類化合物的提取分離及其體外抗菌研究[D]. 烏魯木齊: 新疆大學(xué), 2009.

[9] 高夢祥, 趙喜紅. 柿葉黃酮類物質(zhì)提取工藝研究[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2005(3): 41-43.

[10] 石永平, 汪海. 正交設(shè)計優(yōu)選貫葉連翹中總黃酮提取工藝[J]. 天然產(chǎn)物開發(fā)與研究, 2005, 17(3): 325-326.

[11] 劉穎, 高晗, 范婷婷. 殼聚糖-戊二醛交聯(lián)吸附法固定β-葡萄糖苷酶的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(5): 315-318.

[12] 宮元娟, 王博, 林靜. 香菇冷凍干燥工藝參數(shù)的試驗研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2004, 20(1): 226-229.

[13] 石小瓊. 真空預(yù)冷技術(shù)在子芋冷藏保鮮上的應(yīng)用研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2001, 17(4): 86-90.

Extraction of Total Flavonoids fromMalus sieversiiFruits

Kerimjan TURSUNJAN，Nuramina ABDURUSUL，Tursunay DILXAT，Abdulla ABBAS*
(College of Life Science and Technology, Xinjiang University, U..ru..mqi 830046, China)

Major factors influencing the extraction of total flavonoids fromMalus sieversii(Ldb.) Roem fruits were studied by single factor tests, and the optimal extraction process conditions of total flavonoids were explored by orthogonal tests.Results indicated that the optimal extraction conditions of total flavonoids were ethanol concentration of 55%, extraction temperature of 50 ℃, material-liquid ratio of 1:45 and extraction time of 2 h. Under the optimal extraction process conditions,the extraction rate of total flavonoids was 6.78%. In addition, the extraction rates of total flavonoids from freeze-dryingMalus sieversii, freeze-drying red-marshal, erquzi and small apple were 13.61%, 2.01%, 1.45% and 6.69%, respectively.

Malus sieversii(Ldb.) Roem；flavonoid；freeze-drying

S661.1

A

1002-6630(2012)10-0020-04

2011-09-14

克熱木江·吐爾遜江(1985—)，男，碩士研究生，主要從事植物有效成分分析研究。E-mail：kerim703@126.com

*通信作者：阿不都拉·阿巴斯(1951—)，男，教授，主要從事資源植物研究。E-mail：abdulla@xju.edu.cn