程雅芳，楊 洋，溫富雄，袁經(jīng)權，繆劍華,*

(1.廣西大學生命科學與技術學院，廣西 南寧 530004；2.廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023)

響應面分析法優(yōu)化酶提取甜茶茶多酚工藝

程雅芳1，楊 洋1，溫富雄1，袁經(jīng)權2，繆劍華2,*

(1.廣西大學生命科學與技術學院，廣西 南寧 530004；2.廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023)

利用響應面分析法對復合酶輔助提取甜茶中的茶多酚的工藝進行優(yōu)化。在單因素試驗基礎上選取因素與水平，根據(jù)中心組合的試驗設計原理和響應面分析法，分析各個因素的顯著性和交互作用，結(jié)果確定甜茶中的茶多酚的提取最佳工藝條件為：復合酶是由纖維素酶和果膠酶以3:4的比例混合而成；在45℃的水浴條件下，加酶量為0.6%(m/m)、pH4.95、酶解時間47.76min、料液比1:23.58(g/mL)，酶解后的原料用體積分數(shù)40%的乙醇溶液、料液比1:28(g/mL)、溫度70℃回流提取70min的條件下，茶多酚提取量可達133.2mg/g。

甜茶；茶多酚；酶；響應面分析

廣西大瑤山甜茶屬薔薇科甜茶(Rubus suavissimusS．Lee，Sweet tea)，又名甜葉懸鉤子，為懸溝子屬多年生有刺灌木。性涼，味甘、平，有清熱、潤肺利咽、祛痰止咳之功效。分布于我國南方地區(qū)，主產(chǎn)廣西。甜茶的主要成分有甜茶素、黃酮、茶多酚等，具有消除自由基、抗氧化等生物活性，在抑菌、抗病毒、抑制腫瘤、防治心血管疾病等方面具有良好功效[1-4]。目前國內(nèi)對甜茶茶多酚的提取常用的方法有水提法、水提堿轉(zhuǎn)法[5-6]，本實驗采用復合酶(纖維素酶+果膠酶)輔助乙醇提取法提取茶多酚，以響應面分析法優(yōu)化甜茶茶多酚的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜茶葉采自于廣西金秀縣，烘干粉碎備用。

纖維素酶(1000U/g)、果膠酶(10000U/g)、木瓜蛋白酶(295900U/g) 南寧市基亞實驗用品公司；沒食子酸標準品(＞98%)、福林酚試劑 南寧恒因生物科技有限公司；乙醇、碳酸氫鈉等均為分析純。

UV-1240型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；H H-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；D8023CTL-K4型格蘭仕微波爐 佛山市格蘭仕微波爐電器有限公司；VCX130型超聲波儀 美國Sonics & Materials公司；電熱恒溫干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 茶多酚含量的測定

準確稱取沒食子酸標準品100mg，置100mL容量瓶中，以去離子水溶解，定容后得到?jīng)]食子酸標準溶液。準確吸取沒食子酸溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分別置100mL容量瓶中，分別以水定容至刻度，搖勻，使其質(zhì)量濃度分別為0、10、20、30、40、50μg/mL的沒食子酸；分別取6種沒食子酸各1mL移到試管，分別加入5mL的福林酚試劑，搖勻，反應3～8min，加入4.0mL質(zhì)量分數(shù)75g/L的碳酸鈉溶液，搖勻，室溫靜置60min；在波長765nm處測定吸光度[7]。以沒食子酸含量(y)和吸光度進行線性回歸，得標準曲線方程：

y＝0.0737x－0.0008，R2＝0.9995

1.2.2 甜茶茶多酚提取工藝

工藝流程：干燥的甜茶葉→粉碎過篩→分別考察4種提取方法→定容→按照標準曲線的測定方法，測定樣品中茶多酚的含量。

分別用乙醇回流提取法、超聲波輔助乙醇提取法、微波輔助乙醇提取法、酶輔助乙醇提取法[8-16]比較4種方法的提取量，篩選出最優(yōu)的提取方法。

1.2.3 響應面分析法優(yōu)化酶輔助乙醇提取甜茶茶多酚工藝

考察復合酶輔助乙醇提取方法，采用單因素分析方法對酶的種類、復合酶的用量、乙醇回流時間、酶解時間、酶解溫度、酶解pH值、酶解時液料比等影響因素進行分析，確定單個因素的最優(yōu)提取條件。利用單因素顯著性分析，確定單因素影響因子較高的4個單因素，進一步設計中心組合CCD實驗。即考察復合酶(纖維素酶+果膠酶)用量、酶解pH值、酶解時間和料液比4因素，每個因素取3個水平見表1，以提取量為考察指標，每次作3個平行實驗，優(yōu)選出最佳提取條件。

表1 酶輔助乙醇提取甜茶茶多酚工藝響應面分析試驗設計表Table 1 Factors and levels of RSM design for optimizing enzymeassisted ethanol extraction of polyphenols

2 結(jié)果與分析

2.1 4種提取工藝對甜茶多酚提取的影響

按照1.2.2節(jié)的工藝流程，通過單因素和正交試驗，考察乙醇回流法、超聲波輔助乙醇提取法、微波輔助乙醇提取法和酶輔助乙醇回流提取法對茶多酚提取量的影響，提取量結(jié)果見表2。

表2 4種提取方法對茶多酚提取量的比較Table 2 Comparison of four methods on the extraction rate of polyphenols

表2表明，復合酶輔助提取法對甜茶茶多酚的提取量最高。

2.2 復合酶的篩選

分別考察纖維素酶(Type 1)、纖維素酶與果膠酶合成復合酶(Type 2)、纖維素酶與果膠酶及木瓜蛋白酶的復合酶(Type 3)、果膠酶(Type 4)、木瓜蛋白酶(Type 5)這5種不同組成的酶解體系對茶多酚提取量的影響。結(jié)果如圖1所示，茶多酚提取量最高的為Type 2，即纖維素酶與果膠酶結(jié)合。

圖1 酶種類的變化對茶多酚提取量的影響Fig.1 Effect of enzyme on the extraction rate of polyphenols

2.3 纖維素酶用量對茶多酚提取量的影響

圖2 纖維素酶用量對茶多酚提取量的影響Fig.2 Effect of cellulase content on the extraction rate of polyphenols

按照1.2.2節(jié)工藝流程，分別在0.5g甜茶干粉中加入1、2、3、4、5mg的纖維素酶，即酶與甜茶干粉的質(zhì)量比為2、4、6、8、10mg/g，結(jié)果如圖2所示，在一定量的范圍內(nèi)，隨著纖維素酶的用量的增大，酶與底物作用的機會逐漸增多，酶的催化效率亦逐漸升高，茶多酚提取量逐步提高，當纖維素酶用量增大到3mg時提取量達到最大值；之后再增大酶用量，提取量反而下降?？赡艿脑蚴敲噶窟^高，底物濃度不能對酶達到飽和，致使酶的作用受到抑制。

2.4 復合酶中果膠酶用量對茶多酚提取量的影響

固定每組先加入0.6%纖維素酶后，依次加入1、2、3、4、5mg果膠酶，即酶與甜茶干粉的質(zhì)量比為2、4、6、8、10mg/g，按照1.2.2節(jié)工藝流程，考察復合酶中果膠酶用量對茶多酚提取量的影響。由圖3可知，在一定量的范圍內(nèi)，復合酶中隨著果膠酶的用量的增大，酶與底物作用的機會逐漸增多，酶的催化效率亦逐漸升高，茶多酚提取量逐步提高，當果膠酶用量增大到4mg時提取量達到最大值；之后再增大酶用量，提取量反而下降?？赡艿脑蚴枪z酶量過高，底物濃度不能對酶達到飽和，致使酶的作用受到抑制，而且茶多酚是蛋白質(zhì)的天然吸附劑，兩者結(jié)合會形成聚合沉淀物，從而降低產(chǎn)物得量。

圖3 復合酶中果膠酶用量對茶多酚提取量的影響Fig.3 Effect of pectinase content on the extraction rate of polyphenols

2.5 酶解后回流提取時間對茶多酚提取量的影響

圖4 酶解后回流時間對茶多酚提取量的影響Fig.4 Effect of refluxing time after hydrolysis on the extraction rate of polyphenols

酶解條件保持不變，只改變酶解后乙醇回流提取時間，考察酶解后回流提取時間對茶多酚提取量的影響，結(jié)果如圖4所示，隨著酶解后回流時間的增大，茶多酚提取量增高，繼續(xù)延長回流時間，茶多酚的提取量反而減少，這是因為茶多酚在高溫條件下不穩(wěn)定，主要是發(fā)生聚合和氧化反應，形成復雜聚合物，會引起茶多酚結(jié)構變化，導致茶多酚提取量降低。因此最佳的酶解后回流時間為90min。

2.6 酶解時間對茶多酚提取量的影響

考察酶解時間(15、30、45、60、75min)在其他酶解因素保持不變的情況下對茶多酚提取量的影響。由圖5得知，隨著酶解時間的延長茶多酚提取量增高，當酶解時間為45min時，茶多酚提取量達到最高值。延長酶解時間對茶多酚提取量的提高意義不大，因此，選擇最佳的酶解時間為45min。

圖5 酶解時間對茶多酚提取量的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on the extraction rate of polyphenols

2.7 pH值對茶多酚提取量的影響

圖6 pH值對茶多酚提取量的影響Fig.6 Effect of pH on the extraction rate of polyphenols

考察酶解時pH值(4、4.5、5、5.5、6)在其他酶解條件保持不變的情況下，對茶多酚提取量的影響。因為每種酶都有最適的pH值，對最適pH值的小范圍偏離，雖然酶沒有變性，但會導致酶活性部位的基團粒子發(fā)生改變，從而降低酶的活力；對最適合pH值偏離較大時，會導致酶自身的變性。由圖6可知，pH5.0有利于復合酶發(fā)揮最大活力，破壞細胞壁，降低傳質(zhì)阻力，從而有利于茶多酚的提取；pH值過高或過低都不利于酶解作用，說明微酸性環(huán)境有利于酶的作用。故將最佳提取pH確定為5.0。

2.8 酶解溫度對茶多酚提取量的影響

在保持其他酶解條件不變的前提下，考察酶解溫度(40、45、50、55、60℃)對茶多酚提取量的影響。結(jié)果由圖7可知，溫度升高，茶多酚提取量隨之升高，45℃時復合酶發(fā)揮最大活性和穩(wěn)定性，最大程度地使細胞壁裂解，此溫度下的茶多酚提取量最高；繼續(xù)升高溫度，酶蛋白質(zhì)變性，酶活力減弱，因而得量下降。因此，選取酶解的最適溫度為45℃。

圖7 酶解溫度對茶多酚提取量的影響Fig.7 Effect of hydrolysis temperature on the extraction rate of polyphenols

2.9 酶解時的液料比對茶多酚提取量的影響

在保持其他酶解條件不變的前提下，考察酶解時料液比[(1:10、1:20、1:30、1:40、1:50(g/mL)]對茶多酚提取量的影響。由圖8可知，隨著提取溶劑量的增大，與有效成分的接觸機會增多，茶多酚提取量增高，當料液比為1:20g/mL時，茶多酚提取量達至最大，從降低能耗的角度考慮，增大提取溶劑的量對茶多酚提取的意義不大，因此，本試驗選用1:20(g/mL)為最佳料液比。

圖8 酶解時的料液比對茶多酚提取量的影響Fig.8 Effect of material-liquid ratio on the extraction rate of polyphenols

2.10 響應面分析法優(yōu)化甜茶茶多酚酶解工藝條件

利用軟件Design Expert 7.0.0采用中心組合設計方法(CCD)對酶水解過程進行條件優(yōu)化，結(jié)果見表3。

表3 CCD試驗設計及結(jié)果Table 3 Design and results of CCD tests

通過表3對模型進行多元回歸擬合，獲得甜茶茶多酚得率對編碼自變量——酶用量、pH值、酶解時間、酶解溫度的二次多項回歸方程：

從該模型的方差分析可見，本試驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性(P模型<0.0001)，失擬項在α＝0.05水平上不顯著(P＝0.0661＞0.05)，其校正決定系數(shù)(RAdj2)為0.9766，表明此模型擬合度好，僅有約2.3%的茶多酚得量總變異不能由此模型進行解釋。

表4 回歸方程模型的方差分析Table 4 Analysis of variance for regression equation model

上述方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗表明：在本試驗設計范圍內(nèi)，酶用量、酶解時間和酶解料液比3個因素對茶多酚得率的線性效應顯著；而酶用量和酶解時間兩因素的曲面效應顯著，因此酶用量和酶解時間有明顯交互作用。

2.11 最佳酶解工藝條件的優(yōu)化模型及其檢驗

圖9 各兩因素交互影響甜茶茶多酚提取量的響應面及等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots for effect of cross-interaction among two factors on the extraction rate of polyphenols

由圖9可知，隨著酶用量和酶解時間的增大，甜茶多酚的提取量先快速提高后緩慢降低，適當?shù)脑龃竺笣舛龋黾用附鈺r間，可以一定程度提高茶多酚提取量。酶用量、酶解時間是主要的影響甜茶多酚提取量的因素。

由回歸模型來預測茶多酚得率最高時的酶解條件為酶用量0.6%、pH4.95、時間47.76min、料液比1:23.58(g/mL)，按照該條件進行酶解驗證實驗，黃酮提取量預測值133.18mg/g。6次平行實驗所得黃酮提取量實測值平均為133.05mg/g。實測值與預測值基本一致，證明應用響應曲面法優(yōu)化的酶解輔助乙醇回流提取甜茶茶多酚工藝是穩(wěn)定且可行的。

3 結(jié) 論

采用中心組合設計及響應面分析，建立復合酶輔助乙醇回流提取甜茶茶多酚提取的二次多項式數(shù)學模型。經(jīng)檢驗證明該模型是合理可靠的，能夠較好地預測甜茶茶多酚的提取量。利用模型的響應面及其等高線，對影響茶多酚提取量的關鍵因素及其相互作用進行探討。復合酶輔助乙醇回流提取工藝的最佳條件為復合酶中纖維素酶和果膠酶的比例為3:4、加酶量0.6%(g/g)、pH4.95、酶解時間47.76min、料液比1:23.58(g/mL)，在45℃的水浴條件下處理，再用體積分數(shù)40%的乙醇，1:28(g/mL)的料液比條件下，70℃回流提取70min，茶多酚提取量可達133.2(mg/g)。

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Optimization of Enzymatic Extraction for Tea Polyphenols from Sweet Tea by Response Surface Methodology

CHENG Ya-fang1，YANG Yang1，WEN Fu-xiong1，YUAN Jing-quan2，MIAO Jian-hua2,*
(1. College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China；2. Guangxi Medicinal Herb Garden, Nanning 530023, China)

The extraction process of polyphenols from sweet tea was explored using compound enzyme-assisted extraction.The compound enzymes were composed of cellulose and pectinase at a mixture ratio of 3:4. Based on response surface methodology,the optimal extraction conditions of enzyme-assisted were enzyme dosage of 0.6%, hydrolysis temperature of 45 ℃, extraction pH of 4.95, extraction time of 47.76 min, and solid-liquid ratio of 1:23.58. The ethanol extraction conditions were ethanol concentration of 40% (V/V), extraction time of 70 min, extraction temperature of 70 ℃ and solid-liquid radio of 1:28. Under the optimal extraction conditions, the yield of tea polyphenols was 133.2 mg/g.

sweet tea；tea polyphenols；enzyme；response surface methodology

TS272

A

1002-6630(2012)10-0010-06

2011-03-27

廣西科技廳科技攻關項目(桂科攻07180063)

程雅芳(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為生物制藥。E-mail：avon31@163.com

*通信作者：繆劍華(1961—)，男，研究員，博士，研究方向為藥用植物鑒定。E-mail：mjh1962@vip.163.com