龍騰騰，王靜鳳，趙 芹，張 珣，李曉林，薛長(zhǎng)湖，李兆杰*

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

海參對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究

龍騰騰，王靜鳳，趙 芹，張 珣，李曉林，薛長(zhǎng)湖，李兆杰*

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

目的：研究海參對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。方法： 采用一次性腹腔注射STZ的方法建立糖尿病大鼠模型，在長(zhǎng)期高血糖環(huán)境下造成對(duì)腎臟的損傷。灌胃海參(800mg/(kg·d)8周后，分別檢測(cè)大鼠空腹血糖值、尿糖含量、腎臟指數(shù)和尿總蛋白、微量白蛋白(mAlb)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)排泄率；采用RT-PCR方法測(cè)定大鼠腎臟中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR γ)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF) mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：海參能顯著降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠空腹血糖值、尿糖含量、腎臟指數(shù)以及尿總蛋白、mAlb和NAG排泄率(P＜0.05或P＜0.01)，并且能顯著上調(diào)糖尿病大鼠PPARγ mRNA，下調(diào)TGF-β1和CTGF(P＜0.05) mRNA的表達(dá)。結(jié)論：海參對(duì)糖尿病大鼠具有良好的降血糖及改善腎臟濾過(guò)功能的作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)腎臟中PPARγmRNA的表達(dá)，抑制TGF-β1和CTGF mRNA的表達(dá)有關(guān)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用。

糖尿??；日本刺參；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，已成為糖尿病病人死亡的主要原因。DN的典型病理改變是腎小球硬化，其發(fā)病機(jī)制目前還不完全清楚。已有研究表明，生長(zhǎng)因子如過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPARγ)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforminggrowth factor beta 1，TGF-β1)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)在DN發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，促使細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluar material，ECM)蛋白表達(dá)增多并抑制其降解[1-2]，而ECM 在腎小球的異常沉積是引起腎小球硬化的主要原因[3]。

海參自古以來(lái)被譽(yù)為“海產(chǎn)八珍”之一，是世界上少有的高蛋白低脂低膽固醇的營(yíng)養(yǎng)保健食品，海參中含有海參多糖、海參皂苷、膠原蛋白、腦苷脂、硫酸軟骨素、維生素等多種活性成分，具有抗腫瘤、提高免疫力、調(diào)節(jié)血脂、延緩衰老等藥理功能[4-7]。本實(shí)驗(yàn)用海參灌胃鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠，研究其對(duì)糖尿病大鼠腎臟功能的調(diào)節(jié)作用，并通過(guò)RT-PCR檢測(cè)腎臟PPARγ、TGF-β1和CTGF mRNA的表達(dá)情況，從分子水平上初步探究海參對(duì)腎臟的保護(hù)機(jī)制，旨在為其合理開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干制日本刺參(Apostichopus japonicus)，經(jīng)超微粉碎后以蒸餾水配制成所需濃度懸濁液備用。

SD雄性大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，SPF級(jí)，北京維通利華公司。

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ) 美國(guó)Sigma公司；葡萄糖試劑盒 中生北控生物科技有限公司；N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-a c e t y l-β-D-glucosaminidase，NAG)測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；尿微量白蛋白(microalbuminuria，mAlb)測(cè)試盒 上海太陽(yáng)生物技術(shù)公司；PPARγ、TGF-β1、CTGF及β-actin引物 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Model680酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；CP100MX離心機(jī)日本日立公司；ABI 7500PCR熱循環(huán)儀 美國(guó)ABI公司；GIS-2008凝膠成像系統(tǒng) 上海天能公司；DYY-6B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一公司；HW.SY11-K電熱恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)風(fēng)公司。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5d，隨機(jī)取出10只作為正常對(duì)照組，其余大鼠禁食不禁水12h，一次性腹腔注射STZ 60mg/kg。STZ臨用前溶解于0.1mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.3)，質(zhì)量濃度為2g/100mL。正常對(duì)照組大鼠按10mL/kg注射相應(yīng)體積緩沖液。繼續(xù)飼養(yǎng)3d后，禁食不禁水5h，尾靜脈采血測(cè)空腹血糖值，以血糖值≥16.7mmol/L者為造模成功[8]。

取造模成功的大鼠，按照體質(zhì)量及血糖值隨機(jī)分為模型對(duì)照組和海參劑量組，每組10只。劑量組大鼠灌胃海參 800mg/(kg·d)，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃生理鹽水，灌胃體積為10mL/kg，每天1次，共8周。大鼠于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前3d，單只入代謝籠收集24h尿液，離心分裝，4℃保存待測(cè)；于末次給藥后，大鼠禁食不禁水5h，尾靜脈取血，按照試劑盒方法分離上清，待測(cè)血糖水平。處死大鼠，迅速摘取雙腎稱(chēng)質(zhì)量，取腎皮質(zhì)0.1g置于液氮內(nèi)保存、備用。

1.3.2 空腹血糖和尿糖含量的測(cè)定

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定。

1.3.3 尿總蛋白、mAlb排泄率(UAER)的測(cè)定

尿總蛋白含量，采用雙縮脲法測(cè)定；尿總蛋白排泄率為尿蛋白含量與24h尿量乘積。mAlb含量，參照試劑盒方法檢測(cè)；UAER為mAlb含量與24h尿量乘積。

1.3.4 尿液中NAG排泄率測(cè)定

尿液中NAG含量，參照試劑盒方法檢測(cè)。NAG排泄率為尿液中NAG含量與24h尿量乘積。

1.3.5 腎肥大指數(shù)的測(cè)定

1.3.6 腎臟中TGF-β1、CTGF 和PPARγmRNA的表達(dá)量測(cè)定

采用Trizol試劑提取腎皮質(zhì)總RNA。采用兩步法RTPCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，退火30s，72℃延伸45s，循環(huán)數(shù)次；最后72℃再延伸10min。

表l 引物設(shè)計(jì)、退火溫度及循環(huán)數(shù)Table 1 Primers, annealing temperatures and cycle numbers

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，并利用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描分析，以β-actin作為內(nèi)參校正，用目的基因與β-actin條帶灰度比值代表目的基因的相對(duì)表達(dá)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參對(duì)空腹血糖和尿糖的影響

表2 海參對(duì)大鼠空腹血糖值、尿糖含量、腎臟指數(shù)以及尿總蛋白、mAlb排泄率的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of Apostichopus japonicus on fasting blood glucose,urine glucose, kidney index and the excretion amounts of protein and mAlb in diabetic rats (±s，n=10)

表2 海參對(duì)大鼠空腹血糖值、尿糖含量、腎臟指數(shù)以及尿總蛋白、mAlb排泄率的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of Apostichopus japonicus on fasting blood glucose,urine glucose, kidney index and the excretion amounts of protein and mAlb in diabetic rats (±s，n=10)

注：#.與正常對(duì)照組相比較，有顯著性差異(P＜0.05)；##.與正常對(duì)照組相比較，有極顯著性差異(P＜0.01)；*.與模型對(duì)照組相比較，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與模型對(duì)照組相比較，有極顯著性差異(P＜0.01)。

組別 空腹血糖值/ 24h尿糖值/尿總蛋白排泄率/ UAER/ 腎臟指數(shù)(mmol/L) (mmol/L) (mg/24h) (mg/24h) (g/kg)/正常對(duì)照組 6.51±0.56 0 10.40±2.75 0.37±0.05 3.84±0.50模型對(duì)照組30.02±2.05## 78.32±11.18##34.97±9.15# 0.87±0.05#7.29±0.67#海參組 21.26±3.05** 54.51±6.81** 30.24±6.94 0.70±0.07*6.10±0.78**

如表2所示，模型對(duì)照組的空腹血糖和尿糖含量均顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)。經(jīng)灌胃海參后，二者含量均顯著下降；與模型對(duì)照組相比，分別降低了29.18%(P＜0.05)和16.60%(P＜0.01)，表明海參對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的高血糖癥狀具有明顯的改善作用。

2.2 海參對(duì)尿總蛋白排泄率、UAER的影響

尿總蛋白及mAlb往往被作為早期糖尿病腎病的診斷指標(biāo)。由表2可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠的尿總蛋白排泄率和UAER分別提高了236.25%(P＜0.05)和135.14% (P＜0.05)，出現(xiàn)了明顯的糖尿病腎病狀態(tài)。與模型對(duì)照組相比，海參組尿總蛋白排泄率和UAER分別降低了13.53%和19.54%(P＜0.05)，表明海參能夠降低尿總蛋白的排泄率并顯著抑制尿中mAlb的排出，提示海參對(duì)糖尿病腎病大鼠有治療作用。

2.3 海參對(duì)腎臟指數(shù)的影響

腎臟肥大是糖尿病腎病早期的重要病理特征。由表2可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠的腎臟指數(shù)升高了89.84%(P＜0.05)。灌胃海參后腎肥大指數(shù)較模型對(duì)照組下降了16.32%(P＜0.01)，說(shuō)明海參可顯著抑制高血糖引起的腎臟肥大。

2.4 對(duì)尿液中NAG排泄率的影響

NAG是一種溶酶體酶，其活性增高可作為腎小管細(xì)胞損傷的早期標(biāo)志物[9]。由圖1可見(jiàn)，模型對(duì)照組大鼠NAG排泄率較正常對(duì)照組增高了2.87倍(P＜0.01)，說(shuō)明模型大鼠已出現(xiàn)腎小管損傷。經(jīng)灌胃海參后，海參組NAG排泄率較模型對(duì)照組降低了16.10%(P＜0.05)，表明海參對(duì)腎小管具有保護(hù)作用。

圖1 海參對(duì)模型大鼠NAG排泄率的影響(±s，n=10)Fig.1 Effect of Apostichopus japonicus on the excretion amount of NAG in diabetic rats (±s，n=10)

2.5 對(duì)大鼠腎臟中TGF-β1、CTGF以及PPARγ mRNA表達(dá)量的影響

圖2 海參對(duì)糖尿病大鼠 TGF-β1、CTGF以及PPARγmRNA 表達(dá)的影響(x－± s，n=10)Fig.2 Effect of Apostichopus japonicus on the expression of TGF-β1,CTGF and PPARγ in diabetic rats (±s，n=10)

由圖2可見(jiàn)，模型對(duì)照組大鼠腎臟中TGF-β1和CTGF mRNA 表達(dá)均顯著升高(P＜0.01)，灌胃海參樣品后，二者表達(dá)量均顯著降低，與模型對(duì)照組相比，分別下降了24.39%(P＜0.05)和6.3%(P＜0.05)。與此同時(shí)，模型對(duì)照組PPARγmRNA表達(dá)量明顯下降(P＜0.01)，經(jīng)灌胃海參后，PPARγmRNA表達(dá)量較模型對(duì)照組顯著提高了77.99%(P＜0.05)。

3 討 論

糖尿病所致腎損傷是糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是糖尿病致殘致死的重要原因，其病理學(xué)特征主要是腎臟體積增大，細(xì)胞外基質(zhì)積聚，腎小球?yàn)V過(guò)率增加和蛋白尿[10]。高血糖是糖尿病、腎病的啟動(dòng)因素，也是DN發(fā)生和發(fā)展的基本因素，其可通過(guò)多種途徑損害腎臟[11-12]，因此，控制血糖是防治DN的關(guān)鍵。mAlb是反映腎小球?yàn)V過(guò)功能的主要指標(biāo)，在正常情況下，mAlb很難通過(guò)腎小球基底膜，當(dāng)糖尿病腎病發(fā)生后由于腎小球?yàn)V過(guò)膜電荷的丟失，尤其是基底膜孔徑的改變，導(dǎo)致了mAlb的排出。NAG是來(lái)自腎近曲小管溶酶體內(nèi)的酸性水解酶，是反映腎小管功能的靈敏指標(biāo)[13]。蛋白尿不僅反映腎小球損傷，而且對(duì)腎小球系膜有毒性作用，損害腎小管間質(zhì)等[14-15]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的空腹血糖值、腎臟指數(shù)和尿總蛋白、mAlb、NAG的排泄率，綜合評(píng)價(jià)了其腎損害的程度，結(jié)果表明，海參給藥8周，可明顯降低糖尿病大鼠空腹血糖值、尿糖值和腎臟指數(shù)，有效抑制尿總蛋白、mAlb和NAG的排泄率，增強(qiáng)腎皮質(zhì)中PPARγmRNA的表達(dá)，降低腎皮質(zhì)中TGF-β1、CTGF mRNA的表達(dá)。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子的改變與DN的發(fā)病和細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成及代謝密切相關(guān)[16-17]。TGF-β是一種多功能的肽類(lèi)物質(zhì)，由多種細(xì)胞分泌的具有多重生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，主要存在3種異構(gòu)體，其中腎臟中以TGF-β1為主。TGF-β1是致腎小球硬化最強(qiáng)的細(xì)胞因子，主要由腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞分泌，通過(guò)自分泌與旁分泌途徑，誘導(dǎo)腎小球及ECM積聚，加速 DN 的形成[18]。人體研究表明，DN時(shí)腎小球和腎小管間質(zhì)部TGF-β1表達(dá)水平均升高[19]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，海參能顯著抑制糖尿病模型大鼠腎臟中TGF-β1mRNA的表達(dá)(P＜0.05)，說(shuō)明抑制TGF-β1的表達(dá)是海參保護(hù)糖尿病大鼠腎臟的有效途徑之一。

CTGF是一種富含半胱氨酸的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，在腎臟中含量最豐富。在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用特異性抗CTGF抗體或CTGF反義寡核苷酸探針，可有效抑制TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增生和膠原合成，這提示了CTGF作為T(mén)GF-β的下游調(diào)節(jié)因子, 介導(dǎo)和增強(qiáng)了TGF-β1的促膠原合成與致腎小球硬化作用[20]。Wang Shinong等[2]也認(rèn)為，TGF-β是誘導(dǎo)糖尿病腎病大鼠近曲小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生CTGF增多的主要原因，而CTGF作用于間質(zhì)成纖維細(xì)胞，使ECM過(guò)量合成而沉積，最終導(dǎo)致糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，海參可顯著抑制DN大鼠腎臟中CTGF mRNA表達(dá)，進(jìn)而抑制其腎臟纖維化的進(jìn)程，起到保護(hù)腎臟的作用。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是一類(lèi)由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族，分為3種亞型，其中PPAR γ被認(rèn)為是一種新的治療腎臟疾病的靶點(diǎn)，其與TGF-β1和CTGF關(guān)系密切[21-22]。盧穎[23]認(rèn)為，PPARγ活化可抑制TGF-β1及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞激活，使CTGF表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)合成減少。Zeng等[24]也報(bào)道，PPARγ激動(dòng)劑能延緩和減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠蛋白尿的發(fā)生和程度，減少腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的儲(chǔ)積，下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明海參可激活PPARγ，繼而調(diào)控下游的細(xì)胞因子，具有直接、有益的腎臟保護(hù)作用。

綜上所述，海參對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠具有顯著的降血糖及腎臟保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是海參中含有的多糖、皂苷、膠原蛋白和腦苷脂等活性成分通過(guò)激活PPARγ，抑制TGF-β1活性的發(fā)揮，下調(diào)CTGF的表達(dá)，從而減少ECM的積聚，抑制腎小球肥大，阻斷和減輕腎臟微細(xì)血管病變，提高腎小球的濾過(guò)率，緩解腎小球硬化，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用。

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Protective Effect and Mechanism ofApostichopus japonicuson Kidney of Diabetic Rats

LONG Teng-teng，WANG Jing-feng，ZHAO Qin，ZHANG Xun，LI Xiao-lin，XUE Chang-hu，LI Zhao-jie*
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Objective: To explore the protective effect ofApostichopus japonicuson the kidney of streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats and its possible mechanisms. Methods: A diabetic rat model was developed by a single intraperitoneal injection of STZ at the dose of 60 mg/kg and kidney damage was induced by long-term high levels of blood glucose. The diabetic rats were administered withApostichopus japonicusat the daily dose of 800 mg/kg for 8 consecutive weeks. The changes in fasting blood glucose, urine glucose, renal index, and the excretion amounts of urine protein, mAlb and NAG were determined. The mRNA expression of peroxisome proliferation activated receptor-γ (PPAR γ), transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) and connective tissue growth factor (CTGF) in kidney were assessed by RT-PCR. Results:Apostichopus japonicusshowed remarkable a suppressive effect on fasting blood glucose, uric glucose, kidney index and the excretion amounts of protein, mAlb and NAG in diabetic rats. The expression level of PPARγ mRNA was markedly increased, while the mRNA expression levels of TGF-β1 and CTGF were effectively suppressed byApostichopus japonicus. Conclusion:Apostichopus japonicuscan remarkably reduce blood glucose through improving the expression of PPAR γ and restraining the expression of TGF-β1 and CTGF, which results in a protective effect on kidney damage.

diabetes；Apostichopus japonicus；PPARγ；TGF-β1；CTGF

R322.6；R587.1

A

1002-6630(2012)01-0252-05

2011-03-11

國(guó)家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201105029)；國(guó)際科技合作項(xiàng)目(2010DFA31330)

龍騰騰(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ笊锘钚晕镔|(zhì)。E-mail：kenanlong@126.com

*通信作者：李兆杰(1970— )，男，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工。E-mail：lizhaojie@ouc.edu.cn