王召朋 柴同杰 牟特 呂長輝

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青島地區(qū)兔肺炎克雷伯氏菌分離鑒定

王召朋①柴同杰②*牟特①呂長輝②

（①青島康大外貿(mào)集團(tuán)公司 膠南 266400 ②山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

對(duì)青島地區(qū)某兔場病死兔的病變器官組織進(jìn)行細(xì)菌分離和純培養(yǎng)，對(duì)所分離的細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)特征、理化性質(zhì)和16SrRNA序列的分子鑒定和測序，人工感染以及藥敏試驗(yàn)，判定為肺炎克雷伯氏菌。代表菌株16SrRNA序列長度1414bp，與GeneBank登錄號(hào)為EU360123.1的肺炎克雷伯氏菌16SrRNA序列同源性100%，人工感染小鼠24h全部死亡，對(duì)供試的諾氟沙星等藥物高度敏感，對(duì)供試的強(qiáng)力霉素等中毒敏感，對(duì)頭孢拉定等耐藥。應(yīng)用篩選的敏感藥物，并采取綜合防治措施，使疫情得到了有效控制。

肉兔 肺炎克雷伯氏菌 分離 藥敏試驗(yàn)

肺炎克雷伯氏菌屬腸桿菌科克雷伯氏屬，是一種常見的條件性致病菌，廣泛分布于動(dòng)物的消化道以及水、土壤和谷物中，可引起人畜發(fā)生肺炎、腹膜炎、子宮炎以及腹瀉，甚至發(fā)生敗血癥。近年來現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)方式得到迅猛發(fā)展，但由于養(yǎng)殖戶的管理水平、養(yǎng)殖場的硬軟件設(shè)施跟不上規(guī)模擴(kuò)大的需要等原因，已經(jīng)有多起有該菌引起的家畜感染的報(bào)道。

青島某兔場在入冬后，部分母兔及仔兔發(fā)生腹瀉病死亡，臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹脹，輕度腹瀉，糞便呈深褐色水樣，病例解剖發(fā)現(xiàn)盲腸、小腸漿膜充血出血，充滿氣體，腸內(nèi)為深褐色或紅褐色水樣內(nèi)容物，使用慶大霉素、安普霉素等抗生素治療無效，且發(fā)病率和死亡率升高。為有效控制該病，對(duì)病死兔進(jìn)行了剖檢采樣和病原分離鑒定，并進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)，篩選出有效藥物，及時(shí)進(jìn)行防治。

1 材料和方法

1.1 試劑 DHL瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、脫纖維羊血、麥康凱瓊脂、普通肉湯和生化鑒定管購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR預(yù)混料購自天根生化科技有限公司；Marker2000購自Taraka公司；DNA回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司。

1.2 病原分離培養(yǎng) 取病死兔病變組織，無菌操作劃線接種DHL瓊脂平皿、血瓊脂平皿、營養(yǎng)瓊脂平皿和麥康凱瓊脂平皿，至37℃溫箱培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。

1.3 染色及顯微觀察 將分離培養(yǎng)出的可以菌進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌體形態(tài)。

1.4 生化試驗(yàn) 可疑菌普通肉湯純培養(yǎng)物進(jìn)行三糖鐵、V-P、硝酸鹽還原、M.R、西蒙氏檸檬酸鹽、丙二酸鹽、尿素酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、葡萄糖、乳糖、靛基質(zhì)、半固體動(dòng)力生化試驗(yàn)。

1.5 動(dòng)物試驗(yàn) 試驗(yàn)用小白鼠8只，分試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組4只。將可疑菌普通肉湯培養(yǎng)物試驗(yàn)組每只腹腔注射0.1ml，對(duì)照組每只腹腔注射生理鹽水作為對(duì)照，飼養(yǎng)觀察。對(duì)發(fā)病及死亡小鼠進(jìn)行解剖和病原菌分離培養(yǎng)。

1.6 分子生物學(xué)鑒定 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取的DNA作為模板，引物采用16SrRNA通用引物，上、下游引物序列分別為：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'，由上海生物工程公司和成。PCR反應(yīng)體系25μl：1.0ml的模版DNA，10×PCR buffer (Mg2+free)2.5ml，MgCl2(2.5mmol/L)2ml，dNTP(2.5mmol/L)1.3ml，上下游引物(25μmol/L)各1ml，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.2μl；最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)足到25ml。PCR基本反應(yīng)程序?yàn)?4℃5min、94℃1min、55℃ 1min、72℃70s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖電泳后，按OGEMA凝膠回收試劑盒回收目的片段，送上海生物工程公司測序。

1.7 藥敏試驗(yàn) 取普通肉湯24h純培養(yǎng)物1ml均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平皿上，貼上藥敏紙片，置于37℃溫箱培養(yǎng)24h后觀察試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 病原分離培養(yǎng)結(jié)果 在不同培養(yǎng)基上均長出了較大的粘液狀菌落，相鄰菌落易融合成濃汁樣，接種針挑取時(shí)可拉出絲。在DHL瓊脂平皿上菌落淡粉色、大而隆起、光滑濕潤；在麥康凱瓊脂平皿上菌落呈紅色；在營養(yǎng)瓊脂平皿上菌落乳白色、大而隆起，光滑濕潤；在血瓊脂平皿上不溶血。

2.2 染色鏡檢結(jié)果 革蘭氏染色陰性，短桿菌，單個(gè)或成雙排列，有莢膜，無芽孢。

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果 三糖鐵37℃溫箱培養(yǎng)24h，斜面產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸產(chǎn)氣，硫化氫陰性。其他理化性質(zhì)見表1。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果 普通肉湯培養(yǎng)物接種小鼠后，試驗(yàn)組4只小鼠24h內(nèi)全部死亡，對(duì)照組小鼠全部健活。死亡小鼠肺臟、肝臟細(xì)菌分離培養(yǎng)后染色鏡檢，得到與接種細(xì)菌相同的菌株。

2.5 分子鑒定結(jié)果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖1)。

圖1 PCR鑒定結(jié)果

(M: DL5000，0:陰性對(duì)照，1-3：待測菌株)

測序后經(jīng)BLAST分析測序結(jié)果表明：該菌株16SrRNA與肺炎克雷伯氏菌(GeneBank中的序列注冊號(hào)EU360123.1)的同源性最高，達(dá)100%。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏結(jié)果判定依據(jù)為《抗菌藥物藥敏紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)》。此次分離出的肺炎克雷伯氏菌對(duì)諾氟沙星等藥物高度敏感，對(duì)強(qiáng)力霉素等中度敏感，對(duì)頭孢拉定等耐藥，具體結(jié)果見表2。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 (mm)

3 討論

從本次發(fā)病臨床癥狀、病理變化、鏡檢觀察和生化特性分析，與肺炎克雷伯菌高度相似，通過分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明病原菌與肺炎克雷伯氏菌同源性達(dá)到100%，從而證明了該菌即為肺炎克雷伯氏菌。通過染色鏡檢、生化鑒定等常規(guī)檢測方式與分子生物學(xué)鑒定的對(duì)比，分子生物學(xué)鑒定準(zhǔn)確性最高，操作簡便快捷。

肺炎克雷伯氏菌作為家兔體內(nèi)常在菌群，易引起家兔呼吸和消化系統(tǒng)疾病，且多為散發(fā)性病例，而像本次較大規(guī)模發(fā)病，引起斷奶前仔兔大量腹瀉死亡的病例報(bào)道較少。此次除肺炎克雷伯氏菌外，還分離到了致病性大腸桿菌，發(fā)病初期臨場癥狀與大腸桿菌病較接近，但用藥后病情沒有改善，發(fā)病率和死亡率升高，臨床癥狀也發(fā)生變化，加大用藥量也無明顯改善。說明此次肺炎克雷伯氏菌發(fā)病是由于氣候變化、仔兔體質(zhì)較弱及其他疾病等因素引起的，同時(shí)因該菌具有較強(qiáng)的耐藥性，用藥后仔兔腸道內(nèi)菌群失調(diào)，也是爆本發(fā)病的一個(gè)主要原因。

肺炎克雷伯氏菌可以產(chǎn)生各種使抗生素失活的酶，這是造成該菌具有耐藥性的原因，而且臨床分離的菌株大多為多重耐藥性菌株，給生產(chǎn)中防治該病造成了很大的困難，同時(shí)對(duì)養(yǎng)殖人員的健康也構(gòu)成了一定的威脅。因其耐藥的特性，預(yù)防成為了防治該病的主要手段，增強(qiáng)家兔免疫力，減小或避免各種應(yīng)激，減少抗生素的濫用，都有利于預(yù)防該病的發(fā)生。一旦發(fā)生本病，早期診斷和有效藥物的及時(shí)使用，是治療本病的主要方法。針對(duì)此次肺炎克雷伯氏菌病，除使用有效抗生素外，還配合使用了腸道微生態(tài)制劑，提高體質(zhì)和免疫力，使病情很快得到了控制。

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（2012–03–08）

通訊作者

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1007-1733(2012)05-0016-03