李彥杰，肖國(guó)生，劉仁華，楊俊年

（1.重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶 404000；

2.三峽庫(kù)區(qū)可持續(xù)發(fā)展研究中心，重慶 404000）

重組人基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）血紅素樣蛋白表達(dá)優(yōu)化

李彥杰1，2，肖國(guó)生1，劉仁華1，楊俊年1

（1.重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶 404000；

2.三峽庫(kù)區(qū)可持續(xù)發(fā)展研究中心，重慶 404000）

為確定重組大腸桿菌（BL21（DE3）/PET42a-PEX）最佳表達(dá)條件。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，以目的蛋白PEX表達(dá)量為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行響應(yīng)面分析。響應(yīng)面分析確定的最優(yōu)因素水平組合為：LB培養(yǎng)基pH為7.50，誘導(dǎo)時(shí)菌液OD600為0.60，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.60mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為5.0h。對(duì)此工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證得到目的蛋白PEX表達(dá)量為20.98mg/L。結(jié)果顯示，優(yōu)化了基因重組大腸桿菌表達(dá)人PEX的條件，為實(shí)現(xiàn)基因重組原核工程菌發(fā)酵法制備重組PEX奠定了基礎(chǔ)。

大腸桿菌，基質(zhì)金屬蛋白酶2，血紅素樣蛋白，Box-Behnken設(shè)計(jì)

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMPs）是一組Zn2+依賴性內(nèi)源性蛋白水解酶超家族，在降解包括骨在內(nèi)的全身各種組織細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過(guò)程中扮演著重要角色[1-3]。MMP-2是該家族的重要一員，主要由成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和單核細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌合成[3-5]。MMP-2參與降解IV型膠原蛋白，I型膠原蛋白和細(xì)胞外糖蛋白，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[3，6]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）血紅素樣蛋白（matrixmetalloproteinase 2 hemopexin-like C-terminal domain，PEX）是除MMP-7、MMP-23和MMP-26外所有MMPs在羧基端共有的結(jié)構(gòu)域，體內(nèi)提取的PEX是MMPs的內(nèi)源性抑制劑[7-10]。研究發(fā)現(xiàn)MMP-2-PEX能抑制MMP-2對(duì)ECM的降解、血管的形成、細(xì)胞的遷移和增殖[11-15]。提取人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞總RNA，RTPCR克隆人基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）血紅素樣蛋白的cDNA序列PEX，構(gòu)建原核表達(dá)載體PET42a-PEX，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)后顯示目的蛋白為可溶性表達(dá)[16]。本文采用Box-Behnken設(shè)計(jì)（Box-Behnken design，BBD）的響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）優(yōu)化重組人PEX的可溶性表達(dá)條件，為實(shí)現(xiàn)基因重組原核工程菌發(fā)酵法制備重組PEX奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組大腸桿菌（BL21（DE3）/PET42a-PEX） 本實(shí)驗(yàn)室保存。

M ini-proteantetra小型垂直電泳槽 美國(guó)Bio-rad公司；GelDoc XR凝膠成像儀 配有Quantity One分析軟件，美國(guó)Bio-rad公司；5418型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；S20K型pH計(jì) 瑞士Mettler-Toledo公司；Biophotometer Plus生物分光光度計(jì) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 重組大腸桿菌（BL21（DE3）/PET42a-PEX）涂布到含有100mg/L AMP的LB平板上倒置過(guò)夜，挑取鑒定正確的單克隆接種到100m L含100mg/L AMP的LB液體培養(yǎng)基中，37℃和220r/m in振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后按5‰接入500m L含100mg/L AMP的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，分別收集OD600值為0.20、0.40、0.60、0.80和1.00的菌液10m L備用。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以目的蛋白PEX表達(dá)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究不同LB培養(yǎng)基pH、誘導(dǎo)時(shí)菌液OD600值、IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響。

1.2.3 目的蛋白表達(dá)量分析 裂解單因素誘導(dǎo)表達(dá)后細(xì)菌培養(yǎng)物，10000r/m in離心10m in，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE，Bio-Rad Gel Doc XR凝膠成像儀掃描電泳膠，用Quantity One 4.4.0軟件分析計(jì)算目的蛋白表達(dá)量。

1.2.4 響應(yīng)面的組合實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化PEX可溶性表達(dá)工藝。根據(jù)單因素分析結(jié)果，以LB培養(yǎng)基pH（X1），誘導(dǎo)時(shí)菌液OD600（X2），IPTG誘導(dǎo)濃度（X3）和誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間（X4）進(jìn)行4因素3水平Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。以-1、0、1代表自變量水平，實(shí)驗(yàn)因素及水平編碼如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)因素和水平編碼表Table 1 Coding of levels and factors chosen for the trials

2 結(jié)果與分析

2.1 目的蛋白表達(dá)的單因素分析

圖1 LB培養(yǎng)基pH對(duì)PEX表達(dá)的影響Fig.1 Effectof pH in LB on expression of PEX

2.1.1 LB培養(yǎng)基pH對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響 固定誘導(dǎo)時(shí)菌液OD600為0.40，IPTG濃度為0.40mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間3.0h，LB培養(yǎng)基pH分別設(shè)定為6.00、6.50、 7.00、7.50、8.00，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著pH由6.00增高至7.00，目的蛋白表達(dá)量逐步上升，并在pH在7.00達(dá)到最大值，這是因?yàn)榇竽c桿菌在發(fā)酵中產(chǎn)酸會(huì)使培養(yǎng)基pH下降，而培養(yǎng)基pH下降后會(huì)抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖。當(dāng)pH大于7.50，目的蛋白表達(dá)量開(kāi)始下降。故選擇LB培養(yǎng)基pH為7.0。

2.1.2 誘導(dǎo)時(shí)菌液OD600對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響 固定誘導(dǎo)時(shí)LB培養(yǎng)基pH為7.00，IPTG濃度為0.40mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間3.0h，誘導(dǎo)時(shí)菌液OD600值分別設(shè)定為0.20、0.40、0.60、0.80、1.00，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，OD600為0.20時(shí)，目的蛋白表達(dá)量很低，這是因?yàn)榇藭r(shí)培養(yǎng)液中重組工程菌絕對(duì)數(shù)量較小所致。隨著OD600上升，目的蛋白表達(dá)量逐步上升，并在OD600為0.60時(shí)表達(dá)量最高。OD600大于0.60，目的蛋白表達(dá)量下降，這可能與因?yàn)榫篛D600過(guò)大時(shí)，菌液中活菌數(shù)絕對(duì)數(shù)量下降有關(guān)。故選擇誘導(dǎo)時(shí)菌液OD600為0.60。

圖2 菌液OD600對(duì)PEX表達(dá)的影響Fig.2 Effectof bacterial liquid OD600 on expression of PEX

2.1.3 IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響 固定誘導(dǎo)時(shí)LB培養(yǎng)基pH為7.00，OD600為0.60，誘導(dǎo)時(shí)間3.0h，IPTG誘導(dǎo)濃度分別設(shè)定為0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mmol/L，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著IPTG誘導(dǎo)濃度由0.20mmol/L增高至0.60mmol/L，目的蛋白表達(dá)量逐步增加至最高。IPTG誘導(dǎo)濃度由0.60mmol/L增高至0.80mmol/L，目的蛋白表達(dá)量緩慢降低。這可能是因?yàn)楦邼舛菼PTG的細(xì)胞毒性作用抑制了宿主菌的生長(zhǎng)繁殖。故IPTG誘導(dǎo)濃度選擇0.60mmol/L。

圖3 IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)PEX表達(dá)的影響Fig.3 Effect of induce concentration of IPTG on expression of PEX

2.1.4 誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響 固定固定誘導(dǎo)時(shí)LB培養(yǎng)基pH為7.00，OD600為0.60，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.60，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)定為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0h，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，誘導(dǎo)培養(yǎng)2.0、3.0h時(shí)，目的蛋白表達(dá)量較低。誘導(dǎo)培養(yǎng)4.0h時(shí)，目的蛋白表達(dá)量最高，隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間增加，目的蛋白表達(dá)量緩慢降低。故選擇誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為4.0h。

圖4 誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)PEX表達(dá)的影響Fig.4 Effectof induce time on expression of PEX

2.2 響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果分析 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Design of Box-Behnken experiment

利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合回歸模型為二次方程：Y=18.81+ 4.86X1+0.14X2+0.34X3+3.20X4+0.17X1X2+0.34X1X3+ 2.13X1X4-0.91X2X3+0.087X2X4-0.27X3X4-6.82X12-0.77X22-0.94X32-2.77X42。回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，回歸模型極顯著（p＜0.01）。模型及一次項(xiàng)X1、X4，二次項(xiàng)X12、X42和交互項(xiàng)X1X4極顯著（p＜ 0.01），模型中其余項(xiàng)均不顯著（p＞0.05），表明各因素對(duì)目的蛋白的表達(dá)量不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。計(jì)算擬合模型的判定系數(shù)R2=0.9763，校正判定系數(shù)RAdj2= 0.9527，預(yù)測(cè)判定系數(shù)RPred2=0.8720，且失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），表明模型擬合程度比較好，可以用此模型對(duì)目的蛋白PEX表達(dá)量進(jìn)行分析、預(yù)測(cè)和確定最佳表達(dá)工藝條件。

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)Table 3 Test for significance of regressionmodel

2.2.2 回歸模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 利用Design-Expert 8.0數(shù)據(jù)分析軟件，由模型的二次方程計(jì)算得4個(gè)因素最優(yōu)值為：LB培養(yǎng)基pH為7.48，誘導(dǎo)時(shí)菌液OD600為0.63，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.62mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為4.8h。在此組合下響應(yīng)值Y在實(shí)驗(yàn)區(qū)域內(nèi)可達(dá)最優(yōu)點(diǎn)，即重組人PEX表達(dá)量最大，理論值為21.21mg/L。為驗(yàn)證上述優(yōu)化結(jié)果，按照確定的最優(yōu)條件，實(shí)際取LB培養(yǎng)基pH為7.50，誘導(dǎo)時(shí)菌液OD600為0.60，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.60mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為5.0h進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，重組人PEX的實(shí)測(cè)平均值為20.98mg/L，與模型的預(yù)測(cè)值較為接近，進(jìn)一步說(shuō)明此回歸模型的擬合程度較好。

3 結(jié)論

外源基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的高效表達(dá)，除受表達(dá)系統(tǒng)的啟動(dòng)子、終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和密碼子偏愛(ài)性等影響之外，還受如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH、IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間、誘導(dǎo)時(shí)菌液OD600值和培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分等外界環(huán)境因素的影響。因此選擇合適的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，可有效提高目的基因的表達(dá)量，從而降低實(shí)驗(yàn)成本，提高表達(dá)效率。

響應(yīng)面分析通過(guò)研究實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與多個(gè)實(shí)驗(yàn)因素間的回歸關(guān)系建立回歸方程，然后求解最優(yōu)值。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析要求實(shí)驗(yàn)因素已在最優(yōu)值范圍附近，因此本研究首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)選定了參與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的LB培養(yǎng)基pH、誘導(dǎo)時(shí)菌液OD600、IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間4個(gè)因素，并設(shè)立不同水平，然后應(yīng)用響應(yīng)面分析法建立了目的蛋白表達(dá)量的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，并通過(guò)手動(dòng)優(yōu)化模型。通過(guò)對(duì)優(yōu)化后模型方程求解，得到最佳的工藝條件是：LB培養(yǎng)基pH為7.50，誘導(dǎo)時(shí)菌液OD600為0.60，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.60mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為5.0h。此條件下目的蛋白表達(dá)量為20.98mg/L。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)PEX表達(dá)量接近最大預(yù)測(cè)值，顯示擬合模型對(duì)于基因重組原核工程菌發(fā)酵法制備重組PEX具有實(shí)踐意義。

[1]Brigitte B.New facets of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 as cell surface transducers：Outside-in signaling and relationship to tumor progression[J].Reviews on Cancer，2012，1825（1）：29-36.

[2]Visser，NagaseH.Matrixmetalloproteinasesand tissue inhibitors of metalloproteinases：structure，function and biochemistry[J]. Circulation Research，2003，92（8）：827-839.

[3]AmǎlineiC，Cǎruntu D，Bǎlan RA.Biology ofmetalloproteinases [J].Romanian Journal of Morphology and Embryology，2007，48（4）：323-334.

[4]Jezierska A，Motyl T.Matrixmetalloproteinase-2 involvement in breast cancer progression：amini-review[J].Medical Science Monitor，2009，15（2）：32-40.

[5]Homas P，Lozito，Rocky ST.Endothelial cell microparticles actas centers ofmatrixmetalloproteinsase-2（MMP-2）activation and vascularmatrix remodeling[J].Journalof Cellular Physiology，2012，227：534-549.

[6]Elizabeth F，Amato J，Giaccia.Hypoxia，inflammation，and the tumor microenvironment in metastatic disease[J].Cancer and Metastasis Reviews，2010，29（2）：285-293.

[7]Zucker S，Cao J.Selective matrix metalloproteinase（MMP）inhibitors in cancer therapy[J].Cancer Biology and Therapy， 2009，24（8）：2371-2373.

[8]Dimitra B，William G，Stetler S.Matrix metalloproteinases（MMPs）and tissue inhibitors of metalloproteinases（TIMPs）：Positive and negative regulators in tumor celladhesion[J].Seminars in Cancer Biology，2010，20（3）：161-168.

[9]Janelle LF，Michael J，Chalmers SA，et al.Identification of specific hemopexin-like domain residues that facilitate matrix metalloproteinase collagenolytic activity[J].The Journal of Biological Chemistry，2009，284（36）：24017-24024.

[10]KaiK，VickiP，ZenaW.Matrixmetalloproteinases：regulators of the tumormicroenvironment[J].Cell，2010，141（1）：52-67.

[11]Xua XP，Mikhailovaa M，Chena ZH，et al.Peptide from the C-terminal domain of tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-2（TIMP-2）inhibitsmembrane activation of matrix metalloproteinase-2 （MMP-2）[J].Matrix Biology，2011，30（7）：404-412.

[12]Ravesanker E，Unmesh J，Indra M，et al.The hemopexin domain of MMP-9 inhibits angiogenesis and retards the growth of intracranialglioblastoma xenograft in nudemice[J].Cancer Cell Biology，2009，124（2）：306-315.

[13]Alireza SA，David AC.Integrins in angiogenesis[J]. ANGIOGENESIS，2008（1）：63-73.

[14]Bello L，Lucini V，Carrabba G，et al.Simultaneous inhibition of glioma angiogenesis，cell proliferation and invasion by a naturally occurring fragment of human metalloproteinase-2[J]. Cancer Research，2001，61（24）：8730-8736.

[15]Ezhilarasan R，Jadhav U，Mohanam I，et al.The hemopexindomain of MMP-9 inhibits angiogenesis and retards the growth of intracranial glioblastoma xenograft in nudemice[J]. Cancer，2009，124：306-315.

[16]李彥杰，楊俊年，王保莉，等.人基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）類血紅素結(jié)構(gòu)域克隆及原核表達(dá)[J].西北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，16（6）：94-96.

Optim ization of expression conditions of recombinant human-source matrix metalloproteinase 2 hemopexin-like C-term inal domain

LIYan-Jie1，2，XIAO Guo-sheng1，LIU Ren-hua1，YANG Jun-nian1
（1.College of Life Science and Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404000，China；
2.Research Centre for Sustainable Development，Three Gorges Reservoir Region，Chongqing 404000，China）

To op tim ize fermentation cond itions of Genetically Engineered Escherichia coli（BL21（DE3）/PET42a-PEX），Box-Behnken design was used to estab lish mathematical model based on sing le-factor tests.The response surface methodology（RSM）analysis result showed that the op timal scale of fac tors was：Luria-Bertani liquid culture medium pH7.50，bac terial liquid op tical density（OD600）0.60，induce concentration of IPTG 0.60mmol/L，induce time 5.0h.Under these op tim ized cond itions，the yield of PEX was 20.98mg/L.Op tim ization of exp ression cond itions of genetically engineered Escherichia coli exp ressing recombinant human-source matrixmetallop roteinase 2 hemopexin-like C-term inaldomain was studied，and laid the foundation of generation of human recombinant PEX by fermentation.

Escherichia coli；matrixmetallop roteinase 2；hemopexin-like C-term inaldomain；Box-Behnken design

Q815

A

1002-0306（2012）20-0248-04

2012－04－28

李彥杰（1979-），男，碩士，講師，研究方向：生物技術(shù)。

教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（211150）；重慶三峽學(xué)院項(xiàng)目（2008-sxxyqn-31）。