張 飛，任海偉，*，張 軼，陳曉前，張志剛，石進(jìn)才，李勝召

（1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050；2.甘肅金徽酒業(yè)集團(tuán)有限公司，甘肅隴南742308）

白酒糟水解液的美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化

張 飛1，任海偉1，*，張 軼1，陳曉前1，張志剛2，石進(jìn)才2，李勝召1

（1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050；2.甘肅金徽酒業(yè)集團(tuán)有限公司，甘肅隴南742308）

以酒糟酸酶聯(lián)合水解液為原料制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。采用單因素實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)溫度、時(shí)間和pH 3個(gè)因素對(duì)美拉德反應(yīng)褐變程度的影響，并利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化反應(yīng)條件。結(jié)果表明，酒糟水解液進(jìn)行美拉德反應(yīng)的最佳條件為：溫度110℃，時(shí)間100min和pH10，該條件下吸光度值為0.995，感官評(píng)價(jià)反應(yīng)產(chǎn)物具有獨(dú)特的醬香味。酒糟酸酶聯(lián)合水解液進(jìn)行美拉德反應(yīng)具有可行性。

白酒糟，水解液，美拉德反應(yīng)

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

白酒糟 甘肅金徽酒業(yè)集團(tuán)提供，原料自然風(fēng)干后粉碎過(guò)50目篩，備用；酒糟組成成分為（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 水分4.05%，灰分7.62%，粗纖維32.06%，淀粉15.05%，粗脂肪3.56%，半纖維素13.27%；3，5-二硝基水楊酸 上海中泰化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶（濾紙酶活力2000U/g，最適溫度45℃，最適pH4.5）和中性蛋白酶（酶活力20000U/g，最適溫度50℃，最適pH7.0） 廣西南寧龐博生物工程有限公司；糖化酶（20000U/g，最適溫度60℃，最適pH4.5） 市售；地衣酚 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；D-木糖 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；其余試劑 均為分析純。

HH-4恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；恒溫油浴鍋 自行組裝；TDL-5-A離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；GZX-9240MBE鼓風(fēng)干燥箱 海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Cary 50紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 分析方法

水分含量測(cè)定參照GB 5009.3-2010；粗纖維含量測(cè)定參照GB/T 5009.10-2003；淀粉含量測(cè)定參照GB/T 5009.9-2008；蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照GB 5009.5-2010；脂肪含量測(cè)定參照GB/T 5009.6-2003；半纖維素含量測(cè)定采用VAN SOEST法；木糖含量測(cè)定采用地衣酚法；還原糖含量的測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法；葡萄糖含量的測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法；蛋白肽的測(cè)定采用Lowry法。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酒糟酸酶聯(lián)合水解液的制備 準(zhǔn)確稱取一定量酒糟，以1∶10（w/v）料液比加入由HCl和H3PO4組成的質(zhì)量濃度為2%的混合酸（二者比例相同），攪拌混勻，靜置24h后于120℃酸水解2.5h。酸解結(jié)束后，快速冷卻水解液并調(diào)至最適溫度和pH，依次加入纖維素酶、糖化酶和中性蛋白酶進(jìn)行分段酶解，酶解時(shí)間均為3h，酶添加量依次為2000U/g纖維素、1000U/g淀粉和2000U/g蛋白質(zhì)。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，然后4000r/min離心15min，收集上清液微濾保存?zhèn)溆?。?jīng)檢測(cè)，水解液中蛋白肽質(zhì)量濃度為6.25g/L，還原糖質(zhì)量濃度為28.72g/L，其中木糖質(zhì)量濃度為5.72g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度為11.58g/L。

1.3.2 美拉德反應(yīng) 將1.3.1方法制備的水解液在預(yù)定溫度和pH條件下加熱一定時(shí)間后，冰浴冷卻，5000r/min離心10min，除去反應(yīng)產(chǎn)生的褐色不溶物質(zhì)，上清液用于分析褐變程度。空白進(jìn)行同樣處理。分別考察溫度（70、80、90、100、110、120℃）、時(shí)間（20、40、60、80、100、120min）和pH（5、6、7、8、9、10）3個(gè)因素對(duì)美拉德反應(yīng)褐變程度的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行L9（33）正交實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表1），研究美拉德反應(yīng)的最佳條件。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal tests

1.3.3 美拉德反應(yīng)褐變程度的測(cè)定 高級(jí)階段的糖裂解和Strecker降解對(duì)于美拉德反應(yīng)至關(guān)重要，該過(guò)程產(chǎn)生的酮、醛類等小分子物質(zhì)具有強(qiáng)紫外光吸收，是賦予特征風(fēng)味的成分。故本文采用分光光度法表征小分子物質(zhì)的產(chǎn)生速率和產(chǎn)量[13-14]。將酒糟水解液在不同條件下的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，適當(dāng)稀釋后于200～800nm范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)產(chǎn)物的吸收峰均在280nm左右。因此，本文選取反應(yīng)體系在280nm處的吸光度值（A280）來(lái)反映褐變程度。A280越大表示褐色產(chǎn)物的生成量越多[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 溫度對(duì)美拉德反應(yīng)褐變程度的影響 反應(yīng)溫度是影響美拉德反應(yīng)的重要參數(shù)之一，溫度每增加10℃，反應(yīng)速率就會(huì)增加3～5倍。由圖1可知，隨著溫度的升高，A280呈逐漸上升趨勢(shì)，但上升趨勢(shì)在90℃后趨于放緩。這是因?yàn)?，一方面，酒糟水解液中含有諸多的己糖和戊糖成分，盡管戊糖的反應(yīng)活性高于己糖[17]，但由于木糖等戊糖成分在高溫環(huán)境下容易轉(zhuǎn)化為糠醛類物質(zhì)，造成體系中底物濃度下降，反應(yīng)速率減緩。另一方面，過(guò)高的溫度會(huì)造成蛋白肽的熱降解和糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，甚至可能產(chǎn)生致癌物[10]，而且溫度高于120℃后，反應(yīng)產(chǎn)物帶有明顯的焦糊味等不愉快氣味。故初步選擇反應(yīng)溫度為100℃。

圖1 溫度對(duì)美拉德反應(yīng)褐變程度的影響Fig.1 Effect of temperature on browning of maillard reaction

2.1.2 時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)褐變程度的影響 由圖2可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，A280nm呈先增加后減小的趨勢(shì)，反應(yīng)80min后A280nm最高，說(shuō)明美拉德反應(yīng)產(chǎn)物小分子物質(zhì)的生成速率和消除速率達(dá)到平衡，反應(yīng)達(dá)到終極階段。若再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間反而會(huì)發(fā)生小分子物質(zhì)的聚合反應(yīng)，從而使小分子物質(zhì)的積累表現(xiàn)出一定的消除趨勢(shì)，導(dǎo)致吸收峰強(qiáng)度遲滯不變，甚至下降[13]。故初步選擇反應(yīng)時(shí)間為80min。

圖2 時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)褐變程度的影響Fig.2 Effect of time on browning of maillard reaction

2.1.3 pH對(duì)美拉德反應(yīng)褐變程度的影響 美拉德反應(yīng)的諸多步驟是酸堿催化反應(yīng)，pH因素至關(guān)重要。由表3可知，在pH5～9范圍內(nèi)時(shí)，隨著pH增加，A280nm逐漸增大。因?yàn)椋?dāng)pH≤7時(shí)，Amadori產(chǎn)物主要發(fā)生1，2-烯醇化而形成糠醛類物質(zhì)，該產(chǎn)物在高溫酸性條件下會(huì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙酰丙酸，造成吸光度值增加緩慢；當(dāng)pH介于7～9范圍時(shí)，反應(yīng)較快，吸光度值急劇上升，Amadori產(chǎn)物主要發(fā)生2，3-烯醇化而形成還原酮和很多裂變產(chǎn)物，產(chǎn)物的風(fēng)味協(xié)同作用增強(qiáng)[7]。從圖3還可看出，當(dāng)pH＞9時(shí)，280nm處吸光度值下降，這可能是因?yàn)閜H過(guò)高反而阻礙了美拉德反應(yīng)由高級(jí)階段向終級(jí)階段的進(jìn)一步發(fā)展，導(dǎo)致大分子褐色物質(zhì)的生成速率減緩，不利于褐色物質(zhì)的積累[17-18]。因此初步選擇pH為9。

圖3 pH對(duì)美拉德反應(yīng)褐變程度的影響Fig.3 Effect of pH on browning of maillard reaction

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取一定區(qū)間內(nèi)對(duì)吸光度值（A280nm）影響較顯著的溫度、時(shí)間和pH 3個(gè)因素進(jìn)行L9（33）正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方差分析見(jiàn)表2、表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results and design test of orthogonal tests

從表2可以看出，各因素對(duì)吸光度值的影響大小順序?yàn)镃＞A＞B，最優(yōu)組合為A3B3C3。由表3方差分析結(jié)果可知，pH對(duì)吸光度值影響顯著，其余2因素的影響不顯著。綜合考慮，確定最佳美拉德反應(yīng)條件為A3B3C3，即溫度110℃，時(shí)間100min，pH10。由于組合A3B3C3在上述9組實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)，因此在該最優(yōu)條件下進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)3次，得出反應(yīng)體系的吸光度值為0.995，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有獨(dú)特的醬香味。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests

3 結(jié)論

白酒糟經(jīng)酸酶聯(lián)合水解后，酒糟中的纖維素、半纖維素、淀粉和蛋白質(zhì)等成分被降解，水解液中富含木糖、葡萄糖等還原糖和蛋白肽成分，具有美拉德反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明，利用酒糟酸酶聯(lián)合水解液進(jìn)行美拉德反應(yīng)的最佳條件為：溫度110℃，時(shí)間100min和pH10，該最優(yōu)條件下反應(yīng)體系的吸光度值為0.995，反應(yīng)產(chǎn)物具有獨(dú)特的醬香味。然而，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的香氣成分種類繁多復(fù)雜，羰基化合物、呋喃類化合物和烷基吡嗪等小分子物質(zhì)都可能對(duì)香味具有貢獻(xiàn)作用[19-20]。因此，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的組成成分還需要進(jìn)一步分析研究。

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Optimization of maillard reaction condition for hydrolysates from distiller’s grains

ZHANG Fei1，REN Hai-wei1，*，ZHANG Yi1，CHEN Xiao-qian1，ZHANG Zhi-gang2，SHI Jin-cai2，LI Sheng-zhao1
（1.College of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China；2.Gansu Jinhui Liquor Industry Group Co.，Ltd.，Longnan 742308，China）

In order to improve the development and utilization of distiller’s grains，maillard reaction was used to produce flavor materials by means of united hydrolysates of acid and enzymatic from distiller’s grains.The effects of the factors such as reaction temperature，time and pH on browning were investigated by single factor experiments based on the absorbance of reaction system.Then the maillard reaction conditions were optimized through the orthogonal experiments based on the preceding results.Results indicated that the optimum conditions were 110℃ of reaction temperature，100min of reaction time and pH10 of reaction pH.Under the optimized conditions for maillard reaction，the absorbency of reaction system was 0.995 and the product was of full-bodied sauce flavor by sensory evaluation.The results improved the depth exploitation and utilization of distiller’s grains.

distiller’s grains；hydrolysates；maillard reaction

TS261.9

B

1002-0306（2012）22-0306-04

中國(guó)是一個(gè)白酒消費(fèi)和生產(chǎn)大國(guó)，白酒行業(yè)每年產(chǎn)生大量的廢棄白酒糟（簡(jiǎn)稱酒糟）。一方面由于開(kāi)發(fā)利用不足而造成環(huán)境污染，另一方面酒糟中含有豐富的纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)和半纖維素等成分，又造成資源浪費(fèi)。如何轉(zhuǎn)化利用酒糟生物質(zhì)資源已成為實(shí)現(xiàn)白酒產(chǎn)業(yè)循環(huán)發(fā)展亟待解決的問(wèn)題。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)酒糟的研究主要包括生產(chǎn)燃料乙醇、飼料、木糖醇和沼氣、培養(yǎng)食用菌、釀醋、提取酚酸物質(zhì)等[1-6]。美拉德反應(yīng)是指還原糖與氨基酸、蛋白質(zhì)之間的復(fù)雜反應(yīng)。研究表明，糖的反應(yīng)活性很大程度上取決于其羰基的還原活性[7]，常見(jiàn)糖的反應(yīng)活性順序?yàn)镈-木糖＞L-阿拉伯糖＞己糖（D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-果糖）＞二糖（麥芽糖、乳糖、蔗糖），其中葡萄糖和木糖是美拉德反應(yīng)常用的原料。蛋白酶解物是一種重要的風(fēng)味增強(qiáng)劑，同時(shí)也是美拉德反應(yīng)的前體物，一般通過(guò)熱降解反應(yīng)生成小肽和游離氨基酸或直接通過(guò)肽糖交聯(lián)等方式參與美拉德反應(yīng)[8-9]。諸如大豆肽、牛肉蛋白肽等動(dòng)、植物蛋白的酶解物，通過(guò)美拉德反應(yīng)均能為食品帶來(lái)不同的風(fēng)味特征[10-12]。酒糟中含有豐富的纖維素、半纖維素、淀粉和蛋白質(zhì)等成分，經(jīng)酸酶聯(lián)合水解后能轉(zhuǎn)化為葡萄糖和木糖等糖分以及蛋白肽組分，這為酒糟水解液進(jìn)行美拉德反應(yīng)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。本文以廢棄白酒糟為原料，通過(guò)酸酶聯(lián)合水解將酒糟生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化為富含木糖、葡萄糖和蛋白肽等組分的水解液，進(jìn)行美拉德反應(yīng)。研究反應(yīng)溫度、時(shí)間和pH等因素對(duì)美拉德反應(yīng)褐變程度的影響，優(yōu)化反應(yīng)條件，為酒糟生物質(zhì)資源的轉(zhuǎn)化利用奠定理論基礎(chǔ)。

2012-06-19 *通訊聯(lián)系人

張飛（1981-），男，助理研究員，研究方向：食品生物化學(xué)。

蘭州理工大學(xué)學(xué)科協(xié)調(diào)發(fā)展計(jì)劃和甘肅省青年科技基金計(jì)劃（1107RJYA065）。