陳海琴，楊 波，許慶炎，宋元達，陳 衛(wèi)，張 灝

（江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫 214122）

植物乳桿菌ZS2058生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸反應(yīng)條件的優(yōu)化研究

陳海琴，楊 波，許慶炎，宋元達，陳 衛(wèi)*，張 灝

（江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫 214122）

對本實驗室從泡菜中篩選到的植物乳桿菌ZS2058完整細胞生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的反應(yīng)條件進行了系統(tǒng)研究。在1mL磷酸鉀緩沖液反應(yīng)體系中，通過單因素實驗和響應(yīng)面分析，確定最合適的反應(yīng)條件為：亞油酸底物濃度為0.8mg/mL，細胞濃度為4×1010cfu/mL，反應(yīng)溫度為37℃，緩沖液pH為6.7。在此反應(yīng)條件下，cis9，trans11-CLA的濃度為374.24μg/mL，轉(zhuǎn)化率高達46.78%，這對于實現(xiàn)共軛亞油酸的高效生產(chǎn)和研究其生理功能具有重要的現(xiàn)實意義和理論價值。

共軛亞油酸，生物轉(zhuǎn)化，植物乳桿菌，轉(zhuǎn)化率

共軛亞油酸（Conjugated Linoleic Acid，CLA）是一類由亞油酸（Linoleic Acid，LA）衍生的具有共軛雙鍵的異構(gòu)體的總稱，在共軛亞油酸的各種異構(gòu)體中，c9，t11-CLA和t10，c12-CLA兩種異構(gòu)體被認(rèn)為最具生物活性，特別是c9，t11-CLA在抗動脈粥樣硬化和延緩機體免疫力衰退等方面起著重要作用，c9，t11-CLA是唯一能被動物細胞吸收進入其磷脂層的共軛亞油酸異構(gòu)體[1-2]，而t10，c12-CLA在減肥等[3]方面具有明顯的效果。目前，共軛亞油酸的合成方法主要有化學(xué)法和生物法兩種，但是，化學(xué)法合成共軛亞油酸在其產(chǎn)品中存在多種異構(gòu)體，并且在終產(chǎn)品中會有溶劑殘留，甚至還會產(chǎn)生一些難以處理的反應(yīng)副產(chǎn)物[4]。而生物合成法較化學(xué)法具有異構(gòu)體成分單一、反應(yīng)條件溫和以及產(chǎn)物中具有較高活性的c9，t11-CLA含量高等特點[5]，近年來已成為研究熱點。利用微生物全細胞進行生物轉(zhuǎn)化具有轉(zhuǎn)化效果好、不需添加輔酶及其再生系統(tǒng)等優(yōu)點，細胞中轉(zhuǎn)化用酶或酶系的存在是決定性因素，而選擇一個最佳的反應(yīng)條件能使酶的催化效率顯著提高，原因是酶蛋白的立體結(jié)構(gòu)、活性中心的構(gòu)象受各反應(yīng)條件的影響，包括底物濃度、反應(yīng)介質(zhì)的pH、反應(yīng)溫度等[6-8]。本實驗室已經(jīng)篩選到一株具有生物轉(zhuǎn)化CLA能力的植物乳桿菌ZS2058，已對其在磷酸鉀緩沖溶液體系中的轉(zhuǎn)化條件進行了初步探討[9]。在此基礎(chǔ)上，本文以植物乳桿菌ZS2058完整細胞為研究對象，通過對影響其催化轉(zhuǎn)化的各反應(yīng)條件進行優(yōu)化研究，這為了解其催化轉(zhuǎn)化機理，實現(xiàn)生物法高效合成CLA提供了理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌（L.plantarum ZS2058） 本實驗室從自制泡菜中分離篩選所得[10]，選用MRS培養(yǎng)基進行實驗；亞油酸 純度≥95%，本實驗用脲包法制備；共軛亞油酸 純度≥99%，美國SIGMA公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

GC2010氣相色譜儀 日本島津公司；UNIVERSAL32R冷凍離心機 德國HETTICH公司；BPX-70毛細管色譜柱 120m×0.25mm i.d.×0.25μm，SGE公司；其余為實驗室常規(guī)儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 氣相色譜法（GC） 在前期工作[11]基礎(chǔ)上作了改進，具體如下：

1.2.1.1 氣相色譜條件 柱前壓：366.3kPa；進樣口溫度：250℃；檢測器溫度：250℃；空氣壓力：50kPa；氫氣壓力：60kPa；氮氣壓力：100kPa。

1.2.1.2 程序升溫條件 150℃保持5m in，然后以5℃/m in的升溫速率將溫度升至190℃，在此溫度下保持0.1m in，再以3℃/m in的升溫速率將溫度升至220℃，在此溫度下保持15m in。分流比：5∶1，進樣量：1μL。

1.2.1.3 計算轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中CLA的濃度 采用峰面積歸一化法計算轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中CLA的濃度。

1.2.2 細胞收集 從斜面挑取菌種在10m L MRS培養(yǎng)基中連續(xù)活化兩次，以體積分?jǐn)?shù)1%接種量接入400m LMRS培養(yǎng)基，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)（0.5mg/m L LA誘導(dǎo)）12h。培養(yǎng)結(jié)束后冷凍離心（4500×g，10min，4℃）收集菌體，并用無菌生理鹽水洗滌兩次，洗滌后直接收集細胞或用0.1mol/L的磷酸鉀緩沖溶液（pH 6.5）制成細胞懸浮液備用。

1.2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化實驗

1.2.3.1 反應(yīng)時間對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響 分別取1m L細胞懸浮液置于10m L具塞磨口三角瓶中，添加LA乳濁液至終濃度為0.8mg/m L，使細胞濃度約為4.0×1010cfu/m L，于37℃ 200r/m in條件下分別反應(yīng)0、1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、20、24、26、28h后取出，提取脂肪酸經(jīng)甲酯化后進行GC分析，研究不同反應(yīng)時間生物轉(zhuǎn)化CLA的情況，確定生物轉(zhuǎn)化CLA合適的反應(yīng)時間。

1.2.3.2 氧環(huán)境對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響 分別取1m L細胞懸浮液置于10m L含有不同氧氣濃度（厭氧、微氧和好氧）的三角瓶中，添加LA乳濁液至終濃度為0.8mg/m L，使細胞濃度約為4.0×1010cfu/m L，于37℃200r/m in條件下反應(yīng)24h后取出，提取脂肪酸經(jīng)甲酯化后進行GC分析，研究植物乳桿菌ZS2058在厭氧、微氧和好氧條件下對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響，確定最佳氧氣條件。無氧條件：在10m L具塞磨口三角瓶中，加入1m L細胞懸浮液，充N22m in，排凈三角瓶中的空氣，迅速將磨口塞塞緊。微氧條件：在10m L具塞磨口三角瓶中，加入1m L細胞懸浮液，將磨口塞塞緊，保留三角瓶中9m L的空氣。有氧條件：在10m L敞口三角瓶中，加入1m L細胞懸浮液，用棉布包扎好瓶口，防止空氣中的雜質(zhì)進入，使三角瓶與外界空氣流通。

1.2.3.3 細胞濃度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響 將收集到的細胞用磷酸鉀緩沖溶液稀釋成不同細胞濃度的細胞懸浮液，取1m L懸浮液于10m L具塞磨口三角瓶中，添加LA乳濁液至終濃度為0.8mg/m L，使菌體細胞濃度分別為0、1.0×1010、2.0×1010、3.0×1010、4.0×1010、5.0×1010、6.0×1010cfu/m L，于37℃200r/min條件下反應(yīng)24h后取出，提取脂肪酸經(jīng)重氮甲烷直接甲酯化后進行GC分析，研究細胞濃度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響。

1.2.3.4 底物L(fēng)A濃度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響 取1m L細胞懸浮液于10m L具塞磨口三角瓶中，分別添加LA乳濁液至終濃度為0、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0mg/m L，此時菌體細胞濃度約為4.0×1010cfu/m L，于37℃200r/m in條件反應(yīng)24h后取出，提取脂肪酸經(jīng)重氮甲烷甲酯化后進行GC分析，研究底物濃度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響。

1.2.3.5 反應(yīng)緩沖液pH對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響 將收集到的細胞分別用不同pH 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5的磷酸鉀緩沖溶液進行懸浮，分別取1m L懸浮液于10m L具塞磨口三角瓶中，添加LA乳濁液至終濃度為0.8mg/m L，使菌體細胞濃度約為4.0×1010cfu/m L，于37℃200r/m in條件下反應(yīng)24h后取出，提取脂肪酸經(jīng)甲酯化后進行GC分析，研究pH對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響。

1.2.3.6 反應(yīng)溫度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響 取1m L細胞懸浮液于10m L具塞磨口三角瓶中，添加LA乳濁液至終濃度為0.8mg/m L，此時菌體細胞濃度約為4.0× 1010cfu/m L，分別于不同的溫度條件下（7、17、27、37、47、57℃）200r/m in反應(yīng)24h后取出，提取脂肪酸經(jīng)重氮甲烷甲酯化后進行GC分析，研究反應(yīng)溫度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響。

1.2.3.7 響應(yīng)面分析法優(yōu)化生物轉(zhuǎn)化CLA的條件 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選取生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中影響顯著的底物濃度、細胞濃度和pH三個因素為自變量，以CLA的產(chǎn)量為響應(yīng)函數(shù)，三因素三水平的實驗設(shè)計方案見表1，響應(yīng)面圖的繪制和數(shù)據(jù)處理均采用SAS軟件。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of response surfacemethodology

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)時間對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響

反應(yīng)時間的長短會對生物轉(zhuǎn)化CLA有直接影響，若反應(yīng)時間太短，則CLA的積累不充分；若反應(yīng)時間太長，則CLA易被氧化。反應(yīng)進程曲線見圖1，結(jié)果表明，在整個反應(yīng)過程中，前8h可認(rèn)為是異構(gòu)化反應(yīng)的初始階段，有利于CLA的積累，在此階段c9，t11-CLA的產(chǎn)量隨著反應(yīng)時間的推移呈線性增加；8h之后的反應(yīng)速度增加緩慢，當(dāng)反應(yīng)至15h時，c9，t11-CLA的產(chǎn)量又開始線性增加，直到22h后，CLA的產(chǎn)量不再增加。而t，t-CLA的濃度在整個反應(yīng)的過程中略微上升。

從這個過程還觀察到c9，t11-CLA的產(chǎn)量呈現(xiàn)了二次增長的過程，分析其原因，可能與亞油酸異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化CLA存在明顯的底物抑制作用有關(guān)，關(guān)于其二次增長的機理，將會在后續(xù)工作中進一步研究。

圖1 反應(yīng)進程曲線圖Fig.1 The curve of reaction of the process

2.2 氧環(huán)境對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響

CLA中存在共軛雙鍵，極易被氧化，因此可通過控制反應(yīng)體系中的氧氣條件防止其被氧化。據(jù)Ogawa等[8]報道，利用乳酸菌洗滌細胞的催化能力在微氧條件下更有利于CLA的積累，具有更好的發(fā)展前景。這和鈕曉燕[9]報道的植物乳桿菌ZS2058生物轉(zhuǎn)化CLA不受氧氣濃度的限制，并且CLA的氧化程度亦不會受氧氣濃度的影響的結(jié)論不一致。本文通過改變反應(yīng)體系中不同的氧環(huán)境來研究無氧、微氧和有氧條件對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響。圖2、圖3結(jié)果顯示，植物乳桿菌ZS2058在無氧條件下生物轉(zhuǎn)化CLA時有大量的LA轉(zhuǎn)化成了t，t-CLA；在微氧條件下轉(zhuǎn)化時，LA轉(zhuǎn)化成c9，t11-CLA的比例較高；而在好氧條件下轉(zhuǎn)化時，LA轉(zhuǎn)化成c9，t11-CLA和t，t-CLA的比例相當(dāng)。

圖2 不同含氧環(huán)境下生物轉(zhuǎn)化CLA的GC圖Fig.2 Gas chromatograms of CLA methyl esters produced under different oxygen content

由于c9，t11-CLA被公認(rèn)為是最具有活力的CLA之一，是唯一能被動物細胞吸收進入其磷脂層的共軛亞油酸異構(gòu)體，而關(guān)于t，t-CLA的功能活性未見報道，且關(guān)于分離獲得單個異構(gòu)體的技術(shù)尚未成熟。因此本文選擇在微氧條件下進行反應(yīng)，一方面可以得到較高含量的c9，t11-CLA，另一方面，專一性轉(zhuǎn)化c9，t11-CLA的比例較高，減輕了分離c9，t11-CLA和t，t-CLA的工作。氧環(huán)境對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響實驗表明，活性CLA的產(chǎn)量與氧氣濃度的大小有著密切的聯(lián)系。

圖3 氧氣對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響Fig.3 Effectof oxygen on the bioconversion of CLA

2.3 細胞濃度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響

利用微生物合成CLA，其實質(zhì)是利用細胞中的酶或酶系異構(gòu)化LA。因此，在利用植物乳桿菌ZS2058完整細胞催化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)體系中，可通過改變體系中的細胞濃度來調(diào)節(jié)參與反應(yīng)的酶量，進而獲得較好的轉(zhuǎn)化效果。從圖4可以看出，當(dāng)細胞濃度為4× 1010cfu/m L時，c9，t11-CLA產(chǎn)量比較高，隨著細胞濃度進一步增加，酶量逐漸過量，反應(yīng)達到平衡，終產(chǎn)物比例基本不變。而t，t-CLA的產(chǎn)量與c9，t11-CLA相比較低，當(dāng)細胞濃度為3×1010cfu/m L時產(chǎn)量就趨于平穩(wěn)。

圖4 細胞濃度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響Fig.4 Effectof cellmass on the bioconversion of CLA

2.4 底物濃度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響

在酶催化的反應(yīng)體系中，酶和底物是最基本的構(gòu)成因素。不同的底物濃度（即LA濃度）會直接影響酶催化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)速度，從而影響對底物的轉(zhuǎn)化效果。如圖5所示，在底物濃度小于0.8mg/m L的范圍內(nèi)，細胞量充足，只有少數(shù)的細胞和底物作用生成中間產(chǎn)物，在這種情況下，增加底物的濃度，就會增加產(chǎn)物c9，t11-CLA的含量；當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?mg/m L時，底物濃度足夠大，所有的細胞都與底物結(jié)合反應(yīng)，體系中已經(jīng)沒有游離態(tài)的細胞，繼續(xù)增加底物濃度不能提高產(chǎn)物c9，t11-CLA的量，由于可能存在一定的底物抑制現(xiàn)象，c9，t11-CLA的含量略微有所下降，而t，t-CLA的底物抑制濃度與c9，t11-CLA有所不同，當(dāng)LA濃度為0.3mg/m L的時候就出現(xiàn)了底物抑制現(xiàn)象。

圖5 底物濃度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響Fig.5 Effectof substrate concentration on the bioconversion of CLA

2.5 反應(yīng)緩沖液pH對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響

在微生物細胞生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)過程中，反應(yīng)體系的pH不但會影響酶蛋白的構(gòu)型和酶的穩(wěn)定性以及酶的活性中心必需基團的解離狀態(tài)和底物的解離狀態(tài)，還會影響涉及氧化還原反應(yīng)的輔酶體系和反應(yīng)中氫的傳遞及電子的轉(zhuǎn)移。在最適pH條件下，酶催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)的活性最佳，轉(zhuǎn)化效果最好，高于或低于此pH時，酶的活性會下降。

從圖6可以看出，反應(yīng)體系pH在6.5左右時，植物乳桿菌ZS2058生物轉(zhuǎn)化CLA的產(chǎn)量最高，pH過低或過高都很大程度的影響了酶活，使產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率下降。因此，該反應(yīng)適合在中性環(huán)境中進行。

圖6 反應(yīng)pH對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響Fig.6 Effect of pH value on the bioconversion of CLA

2.6 反應(yīng)溫度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響

反應(yīng)溫度對酶催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響有兩個方面：一方面，隨著溫度升高，活化分子數(shù)增多，酶反應(yīng)速度加快；另一方面，隨著溫度升高，酶蛋白逐步變性失活，酶的活性隨之降低，減弱轉(zhuǎn)化效果。圖7結(jié)果表明，溫度在37℃左右時，較適合生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進行，溫度過低或過高都很大程度的影響酶活，使產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率下降。

2.7 響應(yīng)面分析優(yōu)化生物轉(zhuǎn)化CLA的條件

圖7 反應(yīng)溫度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響Fig.7 Effect of temperature on the bioconversion of CLA

響應(yīng)面實驗設(shè)計的實驗結(jié)果見表2。15個實驗點可分為兩類，其一是析因點，自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點，共有12個析因點；其二是零點，為區(qū)域的中心點，零點實驗重復(fù)3次，用以估計實驗誤差。

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果Table 2 The results of response surface analysis

以CLA產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，運用SAS-RSR（Response Surface Regression）程序?qū)?5個實驗點響應(yīng)值進行回歸分析，經(jīng)回歸擬合后，得到如下回歸方程：

回歸方程及各項的方差分析如表3所示。

從方差分析表中可以看出，各因素中一次項X1、X2項是高度顯著的，二次項X12、X22項也是高度顯著，X1X2項是顯著的。因此，各具體實驗因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，回歸方程也是高度顯著的。相關(guān)系數(shù)R2=0.9725，說明響應(yīng)值（Y）有97.25%來源于所選變量的實驗范圍，即底物濃度、細胞濃度和pH。

從實驗所得的響應(yīng)面分析圖（圖8）上，能夠較為直觀地找出最佳條件及各因素在反應(yīng)中的相互作用。

對回歸方程中X1、X2、X3求偏導(dǎo)，計算得到生物轉(zhuǎn)化CLA的最優(yōu)條件為：底物濃度：0.85mg/m L；細胞濃度：4.13×1010cfu/m L；pH：6.74，得到理論CLA產(chǎn)量為：376.93μg/m L。所以考慮到實際操作的方便，結(jié)合方差分析表及響應(yīng)面分析圖，確定最佳轉(zhuǎn)化CLA的條件為：底物濃度：0.8mg/m L；細胞濃度：4×1010cfu/m L；pH：6.7。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

圖8 生物轉(zhuǎn)化CLA影響因素的RSA響應(yīng)面圖Fig.8 The chartof response surface analysis forCLA transformation condition

在此最佳因素組合的條件下進行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，優(yōu)水平組合條件下反應(yīng)產(chǎn)物的氣相色譜圖見圖9。利用峰面積歸一化法可以求得c9，t11-CLA、t10，c12-CLA和t，t-CLA的濃度分別為374.24、6.71、110.08μg/m L，與理論值相符，CLA總的轉(zhuǎn)化率為60.54%，其中c9，t11-CLA占總CLA含量的77.27%，轉(zhuǎn)化率為46.78%，比鈕曉燕等[9]報道的在20m L的反應(yīng)體系中的CLA轉(zhuǎn)化率提高了47.29%。

圖9 優(yōu)水平組合條件下反應(yīng)產(chǎn)物GC分析圖Fig.9 Gas chromatogram of products under the optimized reaction condition

3 結(jié)論

本文對L.plantarum ZS2058完整細胞在1m L磷酸鉀緩沖液反應(yīng)體系中的反應(yīng)條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，通過單因素實驗和響應(yīng)面分析，確定了最合適的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件，在此反應(yīng)條件下c9，t11-CLA的濃度為374.24μg/m L，轉(zhuǎn)化率高達46.78%。本文的研究工作將為最大限度地發(fā)揮酶催化反應(yīng)的高效率提供實驗依據(jù)，也為實現(xiàn)共軛亞油酸的高效生產(chǎn)和研究其生理功能提供借鑒。

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Study on condition optim ization of conjugated linoleic acid bioconversion by Lactobacillus plantarum ZS2058

CHEN Hai-qin，YANG Bo，XU Qing-yan，SONG Yuan-da，CHENW ei*，ZHANG Hao
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

The converted cond ition of LA to CLA by using Lactobacillus p lantarum ZS2058，which was screened from the Chinese traditional fermented vegetab le，was stud ied.Accord ing to the p roduction of CLA，bioconversion of CLA by resting cells of L.p lantarum ZS2058 in 1m L potassium phosphate buffer system was op tim ized.Through the sing le factor experiment and response surface analysis，374μg/m L of c9，t11-CLA was ob tained under the reaction cond ition as follows：0.8mg/m L LA solution，4×1010c fu/m L cell mass，op timal tem perature 37℃and the op timalpH value 6.7，and the conversion ratio of c9，t11-CLA was 46.78%，which was valuab le for p roducing CLA efficiently and studying its physiological function.

conjugated linoleic acid；bioconversion；Lac tobacillus p lantarum；conversion ratio

Q558

A

1002-0306（2012）22-0192-06

2012－07－20 *通訊聯(lián)系人

陳海琴（1978-），女，博士，副教授，主要從事食品生物技術(shù)方向的研究。

“十一五”國家“863計劃”（2007AA100402）；“十二五”國家“863計劃”（2011AA100905）。