谷勛剛，姚成程，趙雪豐，寧井銘，張正竹

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230036）

普洱茶渥堆樣品及生茶和熟茶中鍵合態(tài)糖苷變化研究

谷勛剛，姚成程，趙雪豐，寧井銘，張正竹

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230036）

采用GC-ECD內(nèi)標(biāo)定量法分析了普洱茶渥堆過(guò)程中鍵合態(tài)糖苷的變化以及不同儲(chǔ)藏年份的生茶和熟茶中含量分布。分析結(jié)果表明，渥堆過(guò)程促進(jìn)糖苷的分解，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，以此為基礎(chǔ)的香氣釋放潛力逐漸降低，酶解和濕熱作用是潛在的驅(qū)動(dòng)力。生茶中糖苷的含量比熟茶高一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，以糖苷為基礎(chǔ)的生茶釋放香氣的潛力遠(yuǎn)大于熟茶。

鍵合態(tài)糖苷，GC-ECD，普洱茶，渥堆，衍生化

鍵合態(tài)糖苷類物質(zhì)是茶樹葉片中重要的次生代謝產(chǎn)物，由揮發(fā)性的苷元和水溶性的糖配基通過(guò)氧鍵結(jié)合而成[1-2]。通過(guò)相關(guān)酶的酶解，苷元能夠很容易地釋放出來(lái)，提供相應(yīng)的香氣[3-4]。茶樹在正常生長(zhǎng)的過(guò)程中，糖苷及對(duì)應(yīng)的酶在不同的細(xì)胞器中，無(wú)法進(jìn)行酶解反應(yīng)，但當(dāng)葉片受到病蟲害侵染時(shí)糖苷與酶有接觸的機(jī)會(huì)，分解釋放出相應(yīng)的苷元[5]。這些揮發(fā)性的成分具有抑制或驅(qū)散病害蟲的作用，因此研究者認(rèn)為糖苷具有抵抗疾病的能力[6-7]。對(duì)茶葉加工而言，苷元一般是優(yōu)質(zhì)的香氣成分，如苯甲醇、氧化芳樟醇、芳樟醇、苯乙醇、己烯醇等表現(xiàn)出花香氣味，是茶葉香氣的內(nèi)質(zhì)體現(xiàn)[8]。因此人們認(rèn)為糖苷是茶葉重要的“香氣前體物”。普洱茶以云南大葉種為原料經(jīng)過(guò)渥堆、后發(fā)酵、壓制成型等工藝制成，其中渥堆是普洱茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵步驟[9]。大葉種茶中內(nèi)容物質(zhì)豐富，其中“香氣前體物”蘊(yùn)藏量相對(duì)更大，在渥堆的過(guò)程中糖苷和相應(yīng)的酶有機(jī)會(huì)接觸，促進(jìn)苷元的釋放，提供相應(yīng)的茶香。此外渥堆過(guò)程中霉菌參與及濕熱條件也可能導(dǎo)致糖苷的水解[10]，釋放出相應(yīng)的苷元。外界環(huán)境條件的改變影響了糖苷在普洱茶樣品中的含量與分配，調(diào)查普洱茶渥堆過(guò)程中糖苷的變化對(duì)渥堆程度的確定及香氣成分的釋放具有重要意義。本文在前期的工作基礎(chǔ)上[11]，采用N-甲基-雙三氟乙酰胺衍生技術(shù)結(jié)合GC-ECD定量方法，考察了普洱茶渥堆過(guò)程中糖苷的變化規(guī)律，同時(shí)對(duì)比分析了不同年份普洱生茶和熟茶中糖苷的含量，以期為普洱茶渥堆過(guò)程中條件的優(yōu)化及后發(fā)酵的最佳時(shí)間確定提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普洱茶渥堆樣品 取自云南勐海茶廠生產(chǎn)車間，在普洱茶堆的相同部位采集8批樣品，每次取樣間隔時(shí)間一周。入堆溫度45℃，至起堆依次變化至55℃；含水率由45%逐漸變化至35%。采集的樣品快速晾干，經(jīng)40℃烘箱內(nèi)平衡6h、研磨、過(guò)30～60目篩；實(shí)驗(yàn)所用05、06及07年的普洱生茶和熟茶 取自勐海茶廠倉(cāng)庫(kù)，其拼配所選原料相同；N-甲基-雙-三氟乙酰胺（MBTFA）；苯氧醇-β-D-葡萄糖苷 St. Louis，MO，USA；順-3-己烯醇-β-D-葡萄糖苷、苯甲醇-β-D-葡萄糖苷、氧化芳樟醇葡萄糖苷、苯乙醇-β-D-葡萄糖苷、香葉醇-β-D-葡萄糖苷、苯甲醇櫻草糖苷 中山大學(xué)藥物學(xué)院；無(wú)水吡啶 Deerfield，IL，USA。

HP6890氣相色譜儀，配分流/不分流進(jìn)樣口、石英毛細(xì)管柱（DB-5，Supelco，Bellefonte，PA，USA；30m×0.25mm×0.25μm）、電子捕獲檢測(cè)器。

1.2 鍵合態(tài)糖苷標(biāo)準(zhǔn)物的衍生反應(yīng)

取400μL的單標(biāo)或混合標(biāo)樣，加入到0.5m L的衍生瓶?jī)?nèi)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入30μL的MBTFA，密封搖勻后，在60℃的溫度范圍下衍生40m in，冷卻至室溫后取2μL進(jìn)樣分析。

1.3 樣品制備

取1.0000g粉碎的普洱茶樣品，加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)苯氧-β-D-葡萄糖苷并混合均勻，液氮保護(hù)下用10m L的甲醇超聲提取10min，離心過(guò)濾后，殘?jiān)^續(xù)重復(fù)超聲提取兩次，合并三次甲醇提取溶液，減壓低溫濃縮至干，然后用5m L的水溶解，用XAD-2大孔樹脂凈化柱（5g，500×1cm ID）去除多酚類、糖類等物質(zhì)。XAD-2大孔樹脂凈化柱預(yù)先依次用20m L水、20m L甲醇、10m L水平衡后，將提取液加到凈化柱上。先用5m L的水淋洗凈化柱，棄去流出液，再用30m L甲醇洗脫，收集甲醇流出液，濃縮至近干后再低溫減壓濃縮，去除可能存在的水分。得到的無(wú)水糖苷在氮?dú)獗Ｗo(hù)下用400μL無(wú)水吡啶溶解，再加入30μL的MBTFA，密封搖勻后，在60℃的溫度范圍下衍生40m in，冷卻至室溫后取2μL進(jìn)樣分析。

1.4 GC-ECD條件

載氣為高純氮?dú)猓銐悍蛛x模式，柱頭壓12.26kPa；分流/不分流進(jìn)樣口溫度280℃；分流進(jìn)樣，分流比5∶1，進(jìn)樣量2μL；ECD檢測(cè)器溫度300℃；升溫程序：初始溫度150℃，保持2m in；以4℃/m in升至210℃并保持2m in；然后以5℃/m in升至280℃，保持7m in。

2 結(jié)果與討論

2.1 鍵合態(tài)糖苷分析方法的確定

鍵合態(tài)糖苷是茶葉中重要的“香氣前體物”，在茶葉中含量較低[12]、具有較好的水溶性，適合用HPLC法測(cè)定。但HPLC法靈敏度不高，并且有些糖苷紫外吸收的摩爾消光系數(shù)很小，很難準(zhǔn)確定量。一般而言，GC法靈敏度比HPLC法高，分離效果好，對(duì)鍵合態(tài)糖苷的測(cè)定，需要經(jīng)過(guò)衍生化過(guò)程以增加糖苷的揮發(fā)性，然后才能測(cè)定，因此采用GC法測(cè)定糖苷，衍生化過(guò)程是必要的。由于普洱茶鍵合態(tài)糖苷的絕對(duì)含量低、種類復(fù)雜，即使是經(jīng)過(guò)衍生化后用GC-FID直接測(cè)定，有些痕量成分在色譜圖上仍然不能辨認(rèn)。解決這種不足的方法至少包括以下兩種：a.在樣品制備時(shí)采用大量待測(cè)樣進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，提取液經(jīng)凈化、濃縮等手段處理后再衍生、GC-FID測(cè)定；b.采用更靈敏的GC檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。若采用前者，用大量樣品進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，在凈化階段去除含量高的茶多酚很繁瑣，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)成分的損失。為此我們選擇了后者，采用了更靈敏的檢查方法，用N-甲基雙三氟乙酰胺（MBTFA）試劑對(duì)糖苷進(jìn)行衍生，在糖苷衍生產(chǎn)物的分子中引入了電負(fù)性大的氟元素，能夠用靈敏度更高的GC-ECD法測(cè)定，大大地增加了分析的靈敏度。

2.2 鍵合態(tài)糖苷標(biāo)準(zhǔn)物的分離分析

幾種標(biāo)準(zhǔn)樣品，包括順-3-己烯醇-β-D-葡萄糖苷、苯氧醇-β-D-葡萄糖苷、苯甲醇-β-D-葡萄糖苷、苯乙醇-β-D-葡萄糖苷、氧化芳樟醇葡萄糖苷、香葉醇-β-D-葡萄糖苷、苯甲醇櫻草糖苷，經(jīng)MBTFA衍生后，用GC-ECD分離與鑒定，得到的色譜圖見圖1。由圖1可見，目標(biāo)成分能夠有效分離和準(zhǔn)確鑒定。由于我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)普洱茶中不含苯氧基葡萄糖苷，可以以該化合物為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他鍵合態(tài)糖苷相關(guān)因子，用內(nèi)標(biāo)法對(duì)茶葉中的鍵合態(tài)糖苷進(jìn)行定量分析，與外標(biāo)法比較，增加了分析的準(zhǔn)確度[13]。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)糖苷色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard glycoside

因?yàn)樘擒諛?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)很難購(gòu)置，多數(shù)需要根據(jù)需要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)合成，所以在我們的研究中，僅能定量分析普洱茶中有限的幾種糖苷。深入研究糖苷的變化及其對(duì)普洱茶品質(zhì)的影響，還需要根據(jù)鑒定的結(jié)果，合成或分離出相應(yīng)的糖苷，進(jìn)而開展定向的研究。普洱茶中潛在未知糖苷，本實(shí)驗(yàn)定量分析中相關(guān)因子取1進(jìn)行處理。

2.3 渥堆樣品中糖苷的變化研究

勐海茶廠取回的渥堆樣品，經(jīng)提取、凈化、衍生后，用GC-ECD對(duì)糖苷進(jìn)行了分離與鑒定，色譜圖如圖2所示。由圖2可見，單糖苷如順-3-己烯醇-β-D-葡萄糖苷、苯氧醇-β-D-葡萄糖苷、苯甲醇-β-D-葡萄糖苷、苯乙醇-β-D-葡萄糖苷、香葉醇-β-D-葡萄糖苷等，色譜峰保留時(shí)間在20～40min之間。ND1和ND2兩個(gè)未知峰也在此范圍內(nèi)，根據(jù)色譜分離的基本原理以及普洱茶樣品成分組成，推測(cè)ND1和ND2可能是單糖苷或單糖，具體是何種成分需要進(jìn)一步證實(shí)。苯甲醇櫻草糖苷為二糖苷，其保留時(shí)間在50～70min之間，因此認(rèn)為ND3～ND9是潛在的二糖苷，集中出現(xiàn)在色譜圖中的50～70min保留時(shí)間范圍內(nèi)，本研究將它們列在了二糖苷的范圍內(nèi)。ND6是一種含量占優(yōu)勢(shì)的二糖苷，研究茶葉中糖苷的含量和性質(zhì)，此糖苷不可忽視。

圖2 第一次翻堆樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of the first pile-turned sample

表1為不同翻堆樣品中糖苷含量，隨著渥堆時(shí)間的延長(zhǎng)，ND3～ND5色譜峰趨向于不可分辨，原因是此三種物質(zhì)在渥堆過(guò)程中逐漸分解而導(dǎo)致含量降低，因此表中未將此三個(gè)潛在的未知糖苷列在表內(nèi)。已知糖苷中，毛茶的含量較高，入堆后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，單糖苷的含量基本上依次降低，表明糖苷隨翻堆次數(shù)增加趨于分解，產(chǎn)生的游離態(tài)香氣構(gòu)成了普洱茶品質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)，糖苷分解的量越多，釋放進(jìn)入到茶葉基質(zhì)中的香氣成分量也越多。表1的結(jié)果證明以糖苷為物質(zhì)基礎(chǔ)的“香氣前體物”釋放香氣的潛力會(huì)逐漸降低，渥堆過(guò)程中酶解、濕熱水解是可能的驅(qū)動(dòng)力[9]。未知糖苷中，如ND6～ND9，它們的含量也很高，在渥堆過(guò)程中表現(xiàn)為同樣的降低趨勢(shì)。根據(jù)色譜性質(zhì)分析，因?yàn)楸Ａ魰r(shí)間靠后，結(jié)合我們酶解的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，芳樟醇糖苷、香葉醇糖苷在普洱茶中含量很高（數(shù)據(jù)未在本文中列出），它們極有可能是芳樟醇或香葉醇的二糖苷或者不同二糖苷的異構(gòu)體。由表1可見，糖苷的變化從入堆開始至起堆止，其總量總體上趨于下降，所以以糖苷為物質(zhì)基礎(chǔ)的香氣前體物釋放香氣的潛力隨渥堆時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)逐漸降低。

2.4 普洱生茶和熟茶中鍵合態(tài)糖苷的研究

表2為普洱生茶和熟茶中糖苷的含量。雖然配制方法相同，但不同年份采集茶葉的內(nèi)質(zhì)還是有一定的區(qū)別。表2顯示生茶糖苷含量高于熟茶至少一個(gè)數(shù)量級(jí)，顯然不完全是茶葉基質(zhì)不同導(dǎo)致的，渥堆過(guò)程是糖苷分解主要?jiǎng)恿?。渥堆時(shí)由于糖苷鍵斷裂，產(chǎn)生了揮發(fā)性的苷元和相應(yīng)的水溶性物質(zhì)，水溶性差的苷元擴(kuò)散至基質(zhì)中，其中一些可能被高含量的脂肪酸、植醇等保持[14]，依然保持苷元的香氣屬性；揮發(fā)度更高的成分可能直接擴(kuò)散出去，對(duì)普洱茶香味的沒有貢獻(xiàn)。事實(shí)上本文探討的這些苷元具有花果香的屬性[15]，而一般普洱茶的香味表現(xiàn)為陳香[8]，顯然陳香物質(zhì)的含量較高，掩蓋了花果香的香型。生茶糖苷含量較高，在貯藏過(guò)程受微生物等的作用緩慢地進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵[9]，其中的糖苷也緩慢的分解，釋放相應(yīng)的苷元。表2中顯示06年的普洱生茶中“總糖苷”的含量為2480μg·g-1，遠(yuǎn)高于05年的含量，可能與后發(fā)酵過(guò)程有關(guān)；而07年普洱生茶“總糖苷”的含量反而更低，我們認(rèn)為主要是基質(zhì)不同導(dǎo)致的。以此看來(lái)，生茶中糖苷含量高、固態(tài)發(fā)酵分解緩慢，以糖苷為基礎(chǔ)的香氣釋放的速率也很慢。

表1 普洱茶渥堆過(guò)程中糖苷的變化（μg·g-1）*Table 1 The change of contentof glycosides during pile-fermentation process of Pu-erh teas（μg·g-1）*

表2 普洱熟茶和生茶中糖苷含量（μg·g-1）*Table 2 The contentof glycoside in Pu-erh ripe and raw tea sample（μg·g-1）*

3 結(jié)論

采用內(nèi)標(biāo)法定量分析了普洱茶渥堆過(guò)程中糖苷含量的變化，開辟了糖苷研究新方法。渥堆時(shí)糖苷釋放香氣的潛力隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，酶解和濕熱作用導(dǎo)致了糖苷的分解并釋放相應(yīng)的苷元，為普洱茶提供香味。同時(shí)對(duì)比研究了普洱生茶和熟茶中糖苷的含量，總體而言，生茶中糖苷的含量比熟茶中至少高一個(gè)數(shù)量級(jí)，表明渥堆是促使糖苷分解的主要過(guò)程，生茶為未發(fā)酵的普洱茶，以糖苷為物質(zhì)基礎(chǔ)的釋放潛力遠(yuǎn)大于熟茶。

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Study on the change of glycosides in pile-fermentation sam p les and raw，ripe of Pu-erh tea

GU Xun-gang，YAO Cheng-cheng，ZHAO Xue-feng，NING Jing-m ing，ZHANG Zheng-zhu
（Key Lab of Tea Biochemistry&Biotechnology，Ministry of Agriculture，AnhuiAgricultural University，Hefei230036，China）

GC-ECD method was emp loyed to quantitatively analyze the change of g lycosides in Pu-erh tea samp les during p ile-fermentative p rocedure，and of the distribution in Pu-erh raw and ripe teas which were stored for different years.The result showed that pile-fermentative p rocess could accelerate deg radation rate of the g lycosides，based on which the aroma-released potentials would be deg reased w ith the p rolonging of the p ile-fermentation time，and enzyme-hyd rolyzed and wet heat actions p rovided a potential d riving force for deg radation of the g lycosides.The content of the g lycosides in Pu-erh raw teas were ten-times higher than that in ripe teas，that intricate the aroma-released potentials in Pu-erh raw teas were much stronger than those in ripe teas.

g lycosides；GC-ECD；Pu-erh tea；p ile-fermentation；derivation

TS272

A

1002-0306（2012）22-0137-04

2012－05－18

谷勛剛，男，博士后，副教授，主要從事茶葉加工及生物化學(xué)研究。

全國(guó)茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目；國(guó)家支撐項(xiàng)目（2007BAD58B04）。