孫艷輝，孟金秀，賈小麗，彭曼莉

（滁州學院生物與食品工程學院，安徽滁州 239012）

氨基酸與丙二醛反應體系的熒光光譜

孫艷輝，孟金秀，賈小麗，彭曼莉

（滁州學院生物與食品工程學院，安徽滁州 239012）

采用熒光光譜法研究氨基酸與丙二醛的反應，考察反應時間、pH和濃度對賴氨酸與丙二醛反應體系發(fā)射光譜的影響，并對不同種類的氨基酸與丙二醛反應進行比較。結果表明，氨基酸與丙二醛反應生成了400nm激發(fā)、460nm發(fā)射的熒光物質(zhì)，該反應在中性條件下易于進行，并隨時間延長產(chǎn)物增多，反應體系中，丙二醛濃度高于賴氨酸濃度有利于生成熒光產(chǎn)物。不同氨基酸與丙二醛反應產(chǎn)物的熒光強度差異明顯，精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、組氨酸等五種氨基酸易與丙二醛反應，脯氨酸、羥脯氨酸、色氨酸未能與丙二醛反應生成熒光物質(zhì)。

賴氨酸，丙二醛，氨基酸，熒光光譜

食品在加工貯藏過程中易發(fā)生脂肪氧化，造成營養(yǎng)物質(zhì)損失和異味產(chǎn)生；同時，脂肪氧化次級產(chǎn)物攻擊蛋白質(zhì)，引起氨基酸側鏈修飾、蛋白質(zhì)主鏈斷裂和蛋白質(zhì)分子間共價交聯(lián)[1-2]。其中，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是最重要的脂肪氧化次級產(chǎn)物，具有很強的生物反應活性，幾乎能攻擊所有的生物大分子，導致其結構的改變和功能的喪失[3-4]。賀洪等[5]采用紫外吸收光譜研究了賴氨酸對丙二醛的清除作用，發(fā)現(xiàn)在400nm處產(chǎn)生了新的吸收峰。Glomb M A等[6]的研究表明，在室溫和中性pH條件下MDA能與生物分子中的氨基特別是精氨酸，組氨酸，賴氨酸殘基反應，引起蛋白交聯(lián)。鄧燕等[7]的研究表明MDA與?；撬岱磻a(chǎn)生一種類似脂褐素（Ex.392～395nm/Em.456～364nm）的熒光產(chǎn)物1，4-二氫吡啶衍生物。這些研究僅對部分氨基酸或蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基進行研究，而采用熒光分析方法對全部自由氨基酸與MDA反應的研究尚未見報道。因此，本文采用熒光光譜法對自由氨基酸與MDA的反應進行探討，先系統(tǒng)考察pH、時間、濃度對賴氨酸與MDA反應的產(chǎn)物熒光強度的影響，進而考察不同種類的氨基酸與MDA反應的熒光產(chǎn)物情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

十九種氨基酸 北京科康生物科技有限公司；1，1，3，3-四乙氧基丙烷 阿拉丁試劑有限公司；鹽酸等 均為分析純。

Cary eclipse型分子熒光分光光度計 Varian，美國瓦里安公司；精密天平，恒溫水浴鍋。

1.2 實驗方法

1.2.1 MDA的配制 按照王愛國[8]的方法，先配制1.5×10-4mol的1，1，3，3-四乙氧基丙烷水溶液，加入1mol/L鹽酸1m L和超純水50m L，將溶液在50℃的水浴中放置1h，即成MDA溶液。1mol的1，1，3，3-四乙氧基丙烷完全水解后可得1mol的MDA。冷卻后定容至100m L，4℃冷藏保存。

1.2.2 反應體系的配制 將MDA和氨基酸按1∶1摩爾比配制，去離子水分別定容至刻度，搖勻，置于37℃恒溫水浴鍋中反應1h，水浴冷卻至25℃后測定熒光光譜。

1.2.3 熒光光譜的繪制 以400nm為激發(fā)波長，420～600nm波長范圍內(nèi)掃描得到熒光發(fā)射光譜；以460nm為發(fā)射波長，350～450nm波長范圍內(nèi)掃描得到熒光發(fā)射光譜；固定Δλ=60nm，在240～700nm波長范圍內(nèi)進行掃描得到同步熒光光譜；掃描時激發(fā)狹縫5nm，發(fā)射狹縫10nm。波長掃描速度為600nm/min。

1.2.4 pH對賴氨酸MDA反應體系熒光發(fā)射光譜的影響 采用1mol/L HCl和1mol/L NaOH調(diào)節(jié)賴氨酸MDA反應體系的pH為1.8、2.2、2.6、3.0、3.7、6.0、6.6、6.9、7.2、9.4、10.5、12后，按1.2.2方法反應后測定熒光發(fā)射光譜。

1.2.5 時間對賴氨酸MDA反應體系熒光發(fā)射光譜的影響 pH為6.0的賴氨酸MDA反應體系分別按按1.2.2方法反應0.5、1、1.5、2、3h后測定熒光發(fā)射光譜。1.2.6 濃度對賴氨酸MDA反應體系熒光發(fā)射光譜的影響 pH為6.0的賴氨酸MDA反應體系，賴氨酸濃度為0.01mmol/L時，MDA濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mmol/L；賴氨酸濃度為0.01mmol/L時，MDA濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mmol/L；按1.2.2方法反應2h后，測定熒光發(fā)射光譜。

1.2.7 不同種類氨基酸與MDA反應的體系熒光發(fā)射光譜 二十種氨基酸，按氨基酸濃度為0.05mmol/L、MDA濃度為0.05mmol/L配制反應液；采用1mol/L HCl和1mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應液的pH為6，按1.2.2方法反應2h后測定熒光發(fā)射光譜。

1.2.8 色氨酸MDA反應體系的熒光發(fā)射光譜 按色氨酸濃度為0.05mmol/L、MDA濃度為0.05mmol/L配制反應液；采用1mol/L HCl和1mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應液的pH為6，按1.2.2方法反應5、7、15、24、48h后測定同步熒光光譜。

1.3 實驗數(shù)據(jù)處理方法

采用Matlab 9.0軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 賴氨酸MDA反應體系的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜

對賴氨酸MDA體系反應1h后按1.2.2方法掃描激發(fā)光譜與發(fā)射光譜，結果可以發(fā)現(xiàn)，賴氨酸MDA體系在400nm波長處有最大吸收，在461nm波長處有最大發(fā)射，而賴氨酸、丙二醛在該處均不出峰，說明賴氨酸MDA體系反應產(chǎn)生了新物質(zhì)。該物質(zhì)的熒光特征和鄧燕等人的研究結果一致[7]，說明該物質(zhì)可能是類脂褐質(zhì)。為研究方便，后續(xù)研究均是對反應體系的發(fā)射光譜開展（Ex.400nm）探討。

圖1 賴氨酸MDA反應體系的激發(fā)光譜和與發(fā)射光譜Fig.1 The excited and emission fluorescence spectroscopy of lysine-MDA system

2.2 pH對賴氨酸MDA反應體系熒光發(fā)射光譜的影響

pH對賴氨酸MDA反應體系熒光發(fā)射光譜的影響如圖2所示。由圖2可以看出，pH為1.8時，賴氨酸MDA反應體系的熒光強度最低，隨著pH由低到高，賴氨酸MDA反應體系熒光強度先升高，在pH為6.0時為最大，然后降低。這說明，偏中性的反應體系有利于賴氨酸與MDA反應，這與賀洪的研究結果一致[5]。后續(xù)研究過程中反應體系pH選為6.0。

圖2 pH對賴氨酸MDA反應體系熒光發(fā)射光譜的影響Fig.2 Effectof pH on the emission fluorescence spectroscopy of lysine-MDA system

2.3 反應時間對賴氨酸MDA反應體系熒光發(fā)射光譜的影響

賴氨酸MDA反應體系熒光發(fā)射光譜隨時間變化的結果如圖3所示。由圖3可以看出，隨著反應時間的延長，賴氨酸MDA反應體系的在461nm處的熒光強度越來越大。這說明產(chǎn)生的熒光物質(zhì)越來越多。后續(xù)研究的反應時間定為2h。

圖3 反應時間對賴氨酸MDA反應體系熒光發(fā)射光譜的影響Fig.3 Effectof reaction time on the emission fluorescence spectroscopy of lysine-MDA system

2.4 濃度對賴氨酸MDA反應體系熒光發(fā)射光譜的影響

賴氨酸與MDA濃度比例發(fā)生變化時，其熒光產(chǎn)物的量也發(fā)生變化，結果如圖4所示。由圖4可以看出，當賴氨酸濃度固定為0.01mmol/L時，隨著丙二醛濃度從0.01mmol/L升高到0.05mmol/L時，反應體系的熒光強度升高；而當賴氨酸濃度固定為0.05mmol/L時，隨著丙二醛濃度從0.01mmol/L升高到0.05mmol/L時，反應體系的熒光強度升高，但最終的熒光強度比較??；這說明，反應體系中，丙二醛濃度越高于賴氨酸濃度時，熒光強度越高。已有文獻表明：一定條件下高濃度的MDA能夠形成乙醛，兩分子MDA和一分子乙醛能與帶初級氨的化合物反應生成二羥吡啶加成物[9-10]，這與本實驗結果一致。

圖4 賴氨酸與MDA濃度比對反應體系熒光發(fā)射光譜的影響Fig.4 Effectof concentration on the emission fluorescence spectroscopy of lysine-MDA system

2.5 酸性側鏈和堿性側鏈與MDA反應的熒光發(fā)射光譜

為研究氨基酸種類與丙二醛反應的熒光特征，首先分別對酸性側鏈氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺），堿性側鏈氨基酸（組氨酸、賴氨酸、精氨酸）與MDA體系的熒光發(fā)射光譜進行掃描，結果如圖5所示。

圖5 酸性側鏈和堿性側鏈氨基酸與MDA反應的熒光發(fā)射光譜Fig.5 The emission fluorescence spectroscopy of lacid or basic chain AA-MDA system

由圖5可以看出，精氨酸與MDA反應體系的熒光強度最高，賴氨酸次之、組氨酸第三、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺相差不大。對于酸性和堿性側鏈來說，氨基酸易于電離，易于發(fā)生反應。其中，精氨酸的氨基、亞氨基最有利于反應，熒光強度最高。賴氨酸、組氨酸也是同樣道理[11]。

2.6 短小側鏈氨基酸與MDA反應的熒光發(fā)射光譜

對蘇氨酸、絲氨酸、亮氨酸、甘氨酸與MDA反應體系的熒光發(fā)射光譜進行掃描，結果如圖6所示。由圖6可以看出，甘氨酸與MDA反應體系的熒光強度最高，絲氨酸的次之、蘇氨酸的第三、丙氨酸的最小。這與甘氨酸的結構有關，在甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸四種氨基酸中，甘氨酸其空間位阻最小，反應最易進行，反應體系的熒光強度最大[11]。

圖6 短小側鏈氨基酸與MDA反應的熒光發(fā)射光譜Fig.6 The emission fluorescence spectroscopy of little side chain AA-MDA system

2.7 長大側鏈氨基酸與MDA反應的熒光發(fā)射光譜

對色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸與MDA反應體系的熒光發(fā)射光譜進行掃描，結果如圖7所示。由圖7可以看出，苯丙氨酸與MDA反應體系的熒光強度最高，甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸相差較小、酪氨酸的反應峰微小，色氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸不能與MDA反應產(chǎn)生。這與長大側鏈氨基酸的結構有關，側鏈長大導致空間位阻大，反應難于進行，反應體系的熒光強度就越小。另外，脯氨酸和羥脯氨酸沒有單獨的氨基，故反應難于進行[11]。

圖7 長大側鏈氨基酸與MDA反應的熒光發(fā)射光譜Fig.7 The emission fluorescence spectroscopy of long side chain AA-MDA system

對不同反應時間的色氨酸MDA體系的同步熒光光譜進行掃描，結果如圖8所示。由圖8可以看出，隨反應時間的延長，色氨酸熒光強度逐漸降低，未發(fā)現(xiàn)新的熒光峰出現(xiàn)。說明MDA對色氨酸具有熒光猝滅作用，二者未產(chǎn)生新的熒光物質(zhì)。這可能是色氨酸的吲哚環(huán)結構抑制了其與MDA的反應。

圖8 色氨酸與MDA反應體系的同步熒光光譜Fig.8 The synchronouns fluorescence spectroscopy of tryptophan-MDA system

3 結論

賴氨酸與丙二醛反應生成400nm激發(fā)、460nm發(fā)射的熒光物質(zhì)，該反應在中性條件下易于進行，并且隨時間延長熒光產(chǎn)物增多；反應體系中，丙二醛濃度高于賴氨酸濃度有利于生成熒光產(chǎn)物。不同氨基酸與丙二醛反應產(chǎn)物的熒光強度差異明顯，精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、組氨酸等五種氨基酸易與丙二醛反應，而脯氨酸、羥脯氨酸、色氨酸未能與丙二醛反應生成熒光物質(zhì)。

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Fluorescence spectroscopy of the reaction system between am ino acid and malondialdehyde

SUN Yan-hui，MENG Jin-xiu，JIA Xiao-li，PENG M an-li
（School of Bio&Food Engineering，Chuzhou University，Chuzhou 239012，China）

The reac tion between am ino acid and malondialdehyde（MDA）was stud ied by fluorescence spectroscopy.The effec t of time，pH and concentration on the em ission spectroscopy of lysine-MDA system was researched，and the reaction charactertic of 19 kinds of am ino acid w ith MDA was compared.The result showed the p roduct of AA-MDA system had Ex.400nm and Em.460nm，easier to happen under the neutral cond ition，w ith the reaction time p rolonged，the fluorescence p roduct inc reased.The concentration of MDA was much more than that of lysine，more fluorescence p roduct increasing.The fluorescence intensity had significant d ifference among kinds of AA-MDA.Arginine，lysine，histidine and g lycine could easier react w ith MDA to p roduce fluorescence p roduct，while p roline，hyd roxyp roline and tryp tophan could not.

lysine；malond ialdehyde；am ino acid；fluorescence spectroscopy

TS201.2

A

1002-0306（2012）22-0042-04

2012－08－28

孫艷輝（1978-），男，博士，副教授，研究方向：食品質(zhì)量安全。

國家自然科學基金項目（30901129）；安徽省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全特色專業(yè)基金項目（20101032）。