覃 嶺 王宇童

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

肝臟是人體參與多種物質(zhì)合成與代謝的重要器官，易受到如病毒、乙醇以及藥物等多種毒物的損害。目前非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)已成為全球肝病學(xué)家廣為關(guān)注的一種肝病。NASH以脂肪變性與脂肪肝為特征，并且越來越多的研究［1-3］表明其與胰島素耐受及代謝綜合征相關(guān)。NASH的病因尚未明了，目前比較認(rèn)同的觀點(diǎn)是“二次打擊”學(xué)說。有研究［4］結(jié)果顯示，過多沉積于肝細(xì)胞的脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)可能是誘發(fā)脂肪肝，造成NASH“第一次打擊”的元兇之一，同時(shí)，F(xiàn)FA所引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生的超氧離子及自由基損傷是造成肝細(xì)胞“第二次打擊”的重要原因。可見，F(xiàn)FA在NASH的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著一個重要的角色。近期還有報(bào)道指出“第二次打擊”還與自然殺傷 T 細(xì)胞(natural killer T，NKT)缺陷［5］，T 細(xì)胞的調(diào)節(jié)異常［6］以及腸道微生物改變［7］有關(guān)。過量的脂質(zhì)堆積在肝細(xì)胞是誘發(fā)肝炎發(fā)生的一個重要的因素［8］，因此，有效地將過量的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)出肝細(xì)胞是防治NASH的一個切入點(diǎn)。

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)可以將細(xì)胞內(nèi)膽固醇和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外的apoA-Ⅰ上，從而促進(jìn)高密度脂蛋白(high density-lipoprotein，HDL)的形成。在此過程中，載脂蛋白 A-Ⅰ(apolipoprotein A-Ⅰ，apoA-Ⅰ)是接受膽固醇和磷脂的關(guān)鍵蛋白，此過程也是高密度脂蛋白合成的限速步驟［9-10］。特異性的蛋白酶、不飽和脂肪酸、胞內(nèi)膽固醇的細(xì)胞毒作用可以降解ABCA1蛋白，近期還有報(bào)道［11］提出，不飽和脂肪酸通過抑制ABCA1的表達(dá)會導(dǎo)致脂質(zhì)在肝癌細(xì)胞HepG2中堆積，apoA-Ⅰ可以與 ABCA1 結(jié)合［12-13］，使 apoA-Ⅰ通過ABCA1上的PEST序列的磷酸化，抑制ABCA1鈣蛋白酶降解，從而增加ABCA1蛋白質(zhì)水平，促進(jìn)脂質(zhì)外流［14-16］。故本課題旨在研究:在過表達(dá)apoA-Ⅰ的細(xì)胞模型中，是否可以通過其對ABCA1的穩(wěn)定作用來減少不飽和脂肪酸對ABCA1的降解來減少脂質(zhì)在肝癌細(xì)胞中的堆積，從而探索一種新方法，通過apoA-Ⅰ/ABCA1途徑改變細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝來預(yù)防NASH的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)室保存的BEL-7402細(xì)胞;Western blotting超敏發(fā)光液、游離脂肪酸超敏測定試劑盒、組織細(xì)胞總膽固醇酶法測定試劑盒、三酰甘油測定試劑盒、Hi-Gene轉(zhuǎn)染試劑(北京普利萊基因技術(shù)有限公司);噻唑藍(lán)(MTT)粉末(北京天來生物科技有限公司);glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)抗體(上?？党缴镉邢薰?;Plasmid Midi Kit(德國Qiagen 公司);pcDNA3.0 vector和 pcDNA3.0/apoA-Ⅰ(Invitrogen，Carlsbad，CA，美國);油紅 O(上海斯紅化工產(chǎn)品有限公司);蛋白酶抑制劑、棕櫚酸(palmitic acid，PA)、油酸(oleic acid，OA)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(Sigma公司，美國);apoA-Ⅰ抗體(Cell Signaling Technology公司，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1)細(xì)胞培養(yǎng)及油紅染色

在35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入蓋玻片，按4×105個細(xì)胞密度接種，用含10%的胎牛血清及1%的雙抗，培養(yǎng)20～24 h，待細(xì)胞匯合率達(dá)到80%，分別用200 μmol/L 和400 μmol/L 的飽和脂肪酸 PA、不飽和脂肪酸 OA及 PA/OA混合物(比例為 PA∶OA=1∶2)［17］加入培養(yǎng)基中作用于細(xì)胞 6、12 及 24 h 后。依次將玻片取出，放入新的孔板中，用室溫PBS沖洗3次，吸干多余水分，用10%中性甲醛固定細(xì)胞10 min，油紅O工作液染色10 min，蘇木精復(fù)染3 min，PBS沖洗10 min，50%甘油水溶液封片，顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)為紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色。

2)質(zhì)粒的制備

按照Qiagene Plasmid Midi Kit說明書操作。首先挑取單克隆pcDNA3.0空載體以及pcDNA3.0/apoA-Ⅰ菌落，制備100 mL相應(yīng)菌液，通過離心使細(xì)菌沉淀;其次，依次加入試劑盒中的P1、P2和P3裂解細(xì)菌，離心取上清;再通過試劑盒中的柱子使帶負(fù)電的DNA黏附于柱子上，通過QBT以及QF將DNA洗滌、洗脫;最后用TE將pcDNA3.0空載體質(zhì)粒以及pcDNA3.0/apoA-Ⅰ質(zhì)粒溶解，測定DNA濃度。

按照HiGene轉(zhuǎn)染試劑說明書的方法采用d=35 mm的培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞。①進(jìn)行細(xì)胞懸液制備:用0.25%胰酶將細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，按照4×105個細(xì)胞/皿準(zhǔn)備細(xì)胞懸液備用;② 進(jìn)行HiGene-DNA轉(zhuǎn)染混合物制備:分別將3 μg質(zhì)粒pcDNA3.0空載體(對照組)和質(zhì)粒 pcDNA3.0/apoA-Ⅰ(實(shí)驗(yàn)組)稀釋于200 μL無菌0.9%氯化鈉注射液，振蕩混勻后，取7.2 μL HiGene加到 DNA溶液中，立即振蕩混勻，室溫靜置15 min后，全部加入到2 mL有血清無雙抗的DMEM中備用;將備好的HiGene-DNA轉(zhuǎn)染混合物加入到培養(yǎng)皿中后立即加入細(xì)胞懸液，實(shí)現(xiàn)鋪板的同時(shí)對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

4)測定細(xì)胞活力

將含有4×104個細(xì)胞的單細(xì)胞懸液100 μL分別接種于96孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞20～24 h后，分別更換含有200 μmol/L及400 μmol/L的不同脂肪酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞6、12及24 h。按照時(shí)間要求，每孔加入50 μL MTT液(2 mg/mL)，37℃、5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)3 h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，每孔加入150 μL DMSO液，避光，振蕩10 min，使結(jié)晶物溶解。通過酶標(biāo)儀，于490 nm波長處測各孔OD值。

5)蛋白定量及蛋白質(zhì)印跡

在4℃條件下，加入裂解液提取人肝癌細(xì)胞系BEL-7402中的蛋白和細(xì)胞培養(yǎng)基中的蛋白。用BCA Protein Assay Kit測定樣品蛋白含量。每個樣本取50 μg蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5% 脫脂奶粉的TBST溶液封閉4 h，加入1∶1 000 apoA-Ⅰ人單克隆抗體于4℃ 孵育過夜。TBST漂洗2次，每次5 min，加入1∶5 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgG，室溫孵育1 h，TBST漂洗6次，每次5 min，GAPDH為內(nèi)參，將膜用化學(xué)發(fā)光試劑孵育1 min，于X膠片上曝光，常規(guī)顯影、定影。將結(jié)果用Genetools軟件(Perkin Elmer)進(jìn)行密度分析。

6)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的測定

分別按照三酰甘油酶法測定試劑盒、游離脂肪酸超敏測定試劑盒以及組織總膽固醇酶法測定試劑盒說明書中針對細(xì)胞測定的方法，采用d=35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，分別按每106個細(xì)胞加0.1 mL相應(yīng)裂解液的比例制備樣品，按照說明書操作，得到相應(yīng)的OD值，后依標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到細(xì)胞內(nèi)三酰甘油、游離脂肪酸以及總膽固醇的濃度，結(jié)果以mmol/L表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件分析，組間比較采用單因素方差分析;以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 油紅O染色觀察NASH細(xì)胞模型中脂質(zhì)的形態(tài)

油紅O染色結(jié)果表明，對照組BEL-7402細(xì)胞生長呈梭狀或扁平多邊形，胞質(zhì)內(nèi)無明顯紅染或淡染;模型組細(xì)胞中，尤其是用不飽和脂肪酸油酸(OA)及混合脂肪酸(PA:OA)作用的細(xì)胞質(zhì)中廣泛染色呈紅色脂滴，大而多，而飽和脂肪酸棕櫚酸(PA)與不飽和脂肪酸及混合脂肪酸相比，形成的脂質(zhì)明顯減少。另外，脂質(zhì)形成隨脂肪酸濃度以及作用時(shí)間的增加而增加(圖1)。

記得2017年12月初，與兒子在綿陽。小子個子瘋長，1米82了，我在他跟前，儼然是他的孩子了。吃飯，休息期間，兒子給我講了很多他讀過的書，有一些新科學(xué)，量子力學(xué)、暗物質(zhì)之類，心生慚愧，也甚為驕傲。此外，兒子對文學(xué)和寫作的理解，也使我自嘆不如。更使我感動的是，在學(xué)校飯?zhí)茫瑑鹤幼屛易?，他給我打飯吃。那一刻，不由笑了，低頭，老淚縱橫。

2.2 MTT法檢測不同脂肪酸對BEL-7402細(xì)胞活性的影響

采用200 μmol/L和400 μmol/L的不同脂肪酸處理BEL-7402細(xì)胞6、12和24 h后，MTT法測量細(xì)胞活性，結(jié)果顯示:飽和脂肪酸棕櫚酸的濃度越高，作用時(shí)間越長，對細(xì)胞活性的影響越大(圖2)。

2.3 Western blotting方法檢測apoA-Ⅰ的轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染了 pcDNA3.0/apoA-Ⅰ的細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)，通過與apoA-Ⅰ抗體作用，在28 000處出現(xiàn)明顯的條帶，而沒有轉(zhuǎn)染的pcDNA3.0空載體的細(xì)胞(對照組)，則不見條帶，說明apoA-Ⅰ轉(zhuǎn)染成功(圖3A)。轉(zhuǎn)染了 apoA-Ⅰ的培養(yǎng)基中有apoA-Ⅰ存在，而轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞培養(yǎng)基中沒有 apoA-Ⅰ(圖 3B)。

2.4 apoA-Ⅰ對BEL-7402細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量的影響

用200 μmol/L 濃度的 BSA、PA、OA、PA:OA 作用于正常細(xì)胞與轉(zhuǎn)染了apoA-Ⅰ的細(xì)胞24 h，分別測定細(xì)胞內(nèi)三酰甘油、游離脂肪酸以及膽固醇的含量。結(jié)果顯示:與正常組(pcDNA3.0組)相比，過表達(dá)apoA-Ⅰ組(pcDNA3.0/apoA-Ⅰ組)細(xì)胞內(nèi)各指標(biāo)均減少。其中棕櫚酸處理后的細(xì)胞脂質(zhì)減少程度弱(圖4)，可能與棕櫚酸本身在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的脂質(zhì)較少有關(guān)。

3 討論

載脂蛋白A-Ⅰ是ABCA1的主要脂質(zhì)接受體，外周組織細(xì)胞內(nèi)過量的脂質(zhì)可以通過ABCA1/apoA-Ⅰ途徑，經(jīng)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇和磷脂的流出。該部分理論的應(yīng)用主要用于防治動脈粥樣硬化性心血管疾病，而在肝臟疾病領(lǐng)域應(yīng)用的研究還比較少。本文主要探索ABCA1/apoA-Ⅰ途徑在非酒精性脂肪性肝炎中的作用。

NAFLD是肝臟排除乙醇及病毒引起的肝臟從單純脂肪變性發(fā)展到脂肪性肝炎、肝纖維化以及肝硬化的一系列病理綜合征。但是其發(fā)病原因并不明確，目前被肝病學(xué)家廣泛認(rèn)同的機(jī)制是“二次打擊”學(xué)說。近年研究［18-20］證實(shí)，游離脂肪酸(free-fatty acid，F(xiàn)FA)能激活使肝臟內(nèi)氧化應(yīng)激亢進(jìn)的轉(zhuǎn)錄因子NFκB，這正是同NASH發(fā)病中的第一、二次打擊均具相關(guān)性的重要因子。而它與肥胖、2型糖尿病以及高脂血癥，尤其是高三酰甘油血癥等代謝綜合征有著密切的關(guān)系。FFA、三酰甘油以及膽固醇是脂質(zhì)的重要成分，因此，研究如何預(yù)防NASH的發(fā)生，可以從減少肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的堆積入手。眾所周知，膽固醇和磷脂等脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程主要在肝臟完成。在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，以apoA-Ⅰ為主的乏脂載脂蛋白可以將外周組織的膽固醇和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟，經(jīng)過肝臟進(jìn)一步的代謝，最終以膽汁酸或膽汁的方式排出［21］。

據(jù)以往研究［22］顯示，只有乏脂的apoA-Ⅰ結(jié)合于細(xì)胞膜上時(shí)，才能與ABCA1結(jié)合，并相互作用，轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇及磷脂，生成HDL。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)的apoA-Ⅰ只有釋放到細(xì)胞外，才可以與ABCA1相互作用，將細(xì)胞內(nèi)過量的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞。這已在本實(shí)驗(yàn)中通過 Western blotting實(shí)驗(yàn)方法得到了驗(yàn)證:apoA-Ⅰ確實(shí)釋放到細(xì)胞外。故該apoA-Ⅰ可以通過與細(xì)胞膜表面的ABCA1相互作用，行使其轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇及磷脂的功能。

本實(shí)驗(yàn)是通過用飽和、不飽和以及混合脂肪酸來構(gòu)建含有脂質(zhì)的BEL-7402細(xì)胞NASH模型，有相關(guān)研究［23］表明飽和脂肪酸棕櫚酸可以誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，本實(shí)驗(yàn)中使用的是人肝癌 BEL-7402細(xì)胞，棕櫚酸是否也會導(dǎo)致該細(xì)胞株的凋亡，以及什么樣的劑量以及作用時(shí)間導(dǎo)致其凋亡我們還不清楚，故本實(shí)驗(yàn)分別用200 μmol/L和400 μmol/L的不同脂肪酸處理BEL-7402細(xì)胞6、12和24 h后，用MTT法測量細(xì)胞活性。原則上選擇最小劑量以及最短作用時(shí)間作為構(gòu)建NASH細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)條件，因此本實(shí)驗(yàn)選擇200 μmol/L濃度為最佳濃度，24 h為最佳作用時(shí)間。另外還有報(bào)道［24］指出，由不飽和脂肪酸衍生出來的含有雙鍵的二酰甘油可進(jìn)一步激活蛋白激酶Cδ(PKCδ)，使ABCA1中絲氨酸的磷酸化水平增加，從而降低ABCA1蛋白穩(wěn)定性，使蛋白降解速度加快。我們在前期研究［11］中發(fā)現(xiàn)，在人的肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中，不飽和脂肪酸通過加快ABCA1的降解來抑制ABCA1蛋白質(zhì)水平，ABCA1的表達(dá)直接影響到細(xì)胞內(nèi)的FFA和三酰甘油的形成，同時(shí)在NASH大鼠肝臟中也看到ABCA1蛋白質(zhì)水平的下降。而本文結(jié)果顯示，在BEL-7402細(xì)胞中，過表達(dá)apoA-Ⅰ后，由不飽和脂肪酸引起的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積程度比對照組細(xì)胞明顯減輕。這與楊峻浩等［25］用apoA-Ⅰ處理單核巨噬細(xì)胞(human acute monocytic leukemia cell line，THP-1)源性泡沫細(xì)胞得到的結(jié)果一致。這些結(jié)果表明，apoA-Ⅰ與ABCA1相互作用一方面可以增強(qiáng)細(xì)胞ABCA1的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能，另一方面apoA-Ⅰ還可以通過和ABCA1結(jié)合，對ABCA1蛋白質(zhì)起到穩(wěn)定作用，從而提高細(xì)胞膜上ABCA1的蛋白質(zhì)水平［26］。近期有實(shí)驗(yàn)結(jié)果［27］顯示，apoA-Ⅰ可降低THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇聚積的機(jī)制可能是通過PKA信號途徑使細(xì)胞ABCA1蛋白質(zhì)水平增加，而在本實(shí)驗(yàn)中，apoA-Ⅰ在肝癌細(xì)胞內(nèi)降低三酰甘油、游離脂肪酸以及膽固醇的聚積可能也是通過該途徑實(shí)現(xiàn)的。脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A羧化酶等與脂質(zhì)合成密切相關(guān)，有文獻(xiàn)［28］報(bào)道，氧甾酮作為LXR的配體，可調(diào)節(jié)這些重要酶的轉(zhuǎn)錄水平。因此我們還可以通過過量表達(dá)apoA-Ⅰ，從轉(zhuǎn)錄水平上，這些下調(diào)與脂質(zhì)合成有關(guān)的酶的表達(dá)，從而降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的堆積。更好地了解ABCA1/apoA-Ⅰ介導(dǎo)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑及其調(diào)節(jié)機(jī)制，通過調(diào)控該途徑相關(guān)基因來防治NASH這一人類面臨的新的挑戰(zhàn)。

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