閆東輝 許淑珍 蘇建榮

(首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院檢驗科，北京 100050)

腸球菌是多重耐藥菌并可獲得和傳遞耐藥性［1］，是當今細菌性感染的治療難題之一。隨著新氟喹諾酮類抗菌藥物在臨床的廣泛應用和時間的延長，在藥物的選擇壓力作用下，腸球菌對此類藥物的耐藥性也在不斷增強［2］。腸球菌對氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolone，F(xiàn)Qs)的耐藥機制主要包括2個方面:拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的改變和藥物的主動外排［3］。拓撲異構(gòu)酶Ⅱ分別由GyrA和GyrB兩對亞單位組成，分別由GyrA和GyrB基因編碼［4］。其中，GyrA基因的突變性在細菌對喹諾酮類藥物的耐藥機制中占重要地位。多聚酶鏈反應-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)作為一種對單堿基置換和多堿基插入或缺失的檢測方法，其靈敏度高、穩(wěn)定性好、簡單快速，因而是分析GyrA基因突變較為成熟和最常用的方法。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株和質(zhì)控菌株

全部實驗菌株經(jīng)過VITEK-2 Compact和 GPI卡片鑒定，其中糞腸球菌30株，屎腸球菌10株。所有實驗菌株對左氧氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥。質(zhì)控菌株為糞腸球菌ATCC 29212。

1.2 實驗試劑

Taq酶、緩沖液、PCR反應管等購自賽百盛公司。引物:上游引物5'-CGG GAT GAA CGA ATT GGG TGT GA-3'，下游引物5'-AAT TTT ACT CAT ACG TGC TTC GG-3'由賽百盛公司合成;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、N，N，N，N-四甲基乙二胺購自 Sigma公司;去離子甲酰胺購自華美生物工程公司;溶菌酶、蛋白酶K、Tris、SDS、EDTA、無水乙醇、異丙醇、NaCl、葡萄糖、冰乙酸、硝酸銀、碳酸鈉、甲醛、氯仿、苯、過硫酸胺等試劑購自北京市化學試劑公司。

1.3 實驗儀器

PCR擴增儀，美國Biotronic公司AG-9600型擴增儀;細菌鑒定儀，VITEK-2 Compact為法國生物梅里埃有限公司產(chǎn)品;TGL-16G-1冷凍離心機、TGL-16B高速臺式離心機購自上海安亭科學儀器廠;DYCP-31D型電泳槽、DYCP-37型電泳槽、WD-9412A型恒溫循環(huán)器、DYY-10C電泳儀 購自北京市六一儀器廠。DNA測序儀為ABI PRISMTM 377-96DNA Sequencer。

1.4 菌株鑒定

使用VITEK-2 Compact和GPI卡片鑒定。

1.5 腸球菌基因組DNA提?。?］

細菌于BHI肉湯中過夜培養(yǎng)，離心收集細菌，蒸餾水洗滌一次后，重懸于200 μL SET，加溶菌酶至濃度5～10 mg/mL，37℃ 作用1～2 h。加1/10體積10%SDS和 5 μL RNase(10 mg/mL)，37 ℃ 孵育 15 min，加20 μL 蛋白酶 K(20 mg/mL)，55 ℃ 作用 2 h，70℃ 加熱15 min失活蛋白酶K，加1/3體積(100 μL)5 mol/L NaCl和1 體積(400 μL)氯仿，顛倒混勻數(shù)次，室溫放置30 min，7 300 r/min離心15 min，吸取水層，加入等體積的異丙醇，沉淀DNA，4℃ 13 000 g高速離心10 min，取沉淀晾干，置于200 μL TE緩沖液，55℃溶解DNA 1 h，－20℃保存。

1.6 PCR 法檢測耐藥基因［3］

20 μL PCR反應體系:TaqDNA聚合酶1 U，10×緩沖液(500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl，1.0%Triton X-100，200 mmol/L MgCl2)2 μL，dNTPs 各 200 μmol/L，上樣染料2 μL，穩(wěn)定劑2 μL，模版2 μL，引物各1.0 μmol/L。引物:上游引物 5'-CGG GAT GAA CGA ATT GGG TGT GA-3'，下游引物5'-AAT TTT ACT CAT ACG TGC TTC GG-3'。循環(huán)條件:預變性94℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火50 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，30個循環(huán)。在試驗過程中同時設陽性及陰性對照，GyrA是腸球菌基因的正常組成部分，用糞腸球菌ATCC29212做陽性對照;反應體系中不加入DNA模板做陰性對照。

1.7 瓊脂糖凝膠電泳

1% ～1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在UV光源下觀察結(jié)果并照相保存，同時把PCR產(chǎn)物進行單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析。

1.8 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析［5］

樣品的制備:5 μL PCR擴增產(chǎn)物與等量的2×變性上樣緩沖液(95%去離子甲酰胺，20 mmol/L EDTA，0.05%溴酚藍，0.05%二甲苯青)混合，98 ℃變性10 min，迅速冰浴驟冷。凝膠的制備:30%丙烯酰胺溶液的制備:100 mL去離子水中加入29 g丙烯酰胺、1 g N、N-二甲基丙烯酰胺。10%過硫酸銨的制備:10 mL去離子水中加入1 g過硫酸銨。凝膠溶液的配制及灌膠:根據(jù)PCR產(chǎn)物片段的長度配制8%的凝膠濃度，將配好的溶液用注射器緩慢連續(xù)灌注到傾斜30°角的兩塊玻璃板縫隙中，避免出現(xiàn)氣泡。過20～30 min出現(xiàn)Schlieren折射線說明凝膠已形成。小心揭去上層短玻璃。

1.9 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)

實驗前2 h開啟低溫循環(huán)器，將冷卻板提前預冷至4℃。將長玻璃板及附著其上面的凝膠放置在冷卻板上。打開電泳儀開關(guān)，首先預電泳至電流恒定。將PCR變性產(chǎn)物8 μL與少量的上樣緩沖液Ⅰ混合后加樣至1 mm×3 mm的WhatmanⅢ 號濾紙上，整齊貼于凝膠一端，相應的未變性PCR產(chǎn)物作參照。電泳開始5 min電壓為250～300 V，5 min后電壓改為100～120 V。電泳時間為12～15 h。

1.10 銀染色

每次新鮮配制下列溶液:①凝膠固定液:450 mL去離子水中加入50 mL冰乙酸;②顯影液:500 mL去離子水中加入 15 g Na2CO3、0.75 mL 37%甲醛、400 μL硫代硫酸鈉(10 mg/mL)，放置4℃冰箱預冷;③染色液:500 mL去離子水中加入0.5 g硝酸銀，0.75 mL 37%甲醛。將電泳后的凝膠同長玻璃板一起放入凝膠固定液中固定20 min。固定結(jié)束后回收固定液作為顯色后的定影劑。用去離子水漂洗凝膠3次，漂洗過程中注意動作要慢，以免損壞凝膠。加入染色液緩慢搖動染色60 min。用去離子水漂洗凝膠半分鐘后加入預冷的顯影液緩慢搖動直至凝膠上顯出條帶。向塑料皿中加入等體積的凝膠固定液(即開始回收的)緩慢搖動2～3 min以中止顯色反應。用去離子水漂洗凝膠2次。凝膠在空氣中干燥后即可觀察記錄條帶。

1.11 結(jié)果判讀

未變性的雙鏈走在前端，并應位于ladder marker相應大小條帶的水平;單鏈走在后端，可有1到2條，將單鏈的帶型與敏感株的單鏈帶型比較，位置不同者判讀為異常條帶。

1.12 基因測序及結(jié)果分析

測序菌株的選擇:對于聚丙烯酰胺凝膠電泳不同的電泳帶型，每種帶型隨機選取2株進行測序。同時對糞腸球菌ATCC29212的PCR產(chǎn)物進行測序。序列結(jié)果分析:用NCBI中的Blast軟件與基因庫(Genbank)中的相應基因序列進行對比分析。

1.13 利血平對糞腸球菌多重耐藥泵的抑制

使用瓊脂稀釋法［6］把30株對高濃度慶大霉素耐藥的糞腸球菌在含有利血平(20 μg/mL)和不含利血平，但是都含有二倍稀釋的環(huán)丙沙星(MIC值范圍是0.25～64 μg/mL)的M-H瓊脂上進行平行試驗，比較兩者MIC值的不同。

2 結(jié)果

2.1 腸球菌GyrA基因片段的PCR-SSCP結(jié)果

2.1.1 PCR方法檢測腸球菌GyrA基因

40株腸球菌(糞腸球菌30株，屎腸球菌10株)、糞腸球菌ATCC29212均擴增出241 bp GyrA基因片段，陰性對照未擴增出條帶。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

圖1 腸球菌GyrA基因PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 Enterococci GyrA gene PCR amplification products M:DNA Marker;N:negative control;P:positive control;1 ～6:samples.

2.2 SSCP 結(jié)果

40株對左氧氟沙星和環(huán)丙沙星都耐藥腸球菌的雙鏈電泳條帶都在DNA MarkerⅡ的200 bp附近，其中有24株糞腸球菌和4株屎腸球菌與敏感株和糞腸球菌ATCC 29212電泳條帶不同。其他12株腸球菌的電泳條帶未發(fā)生變化。PAGE電泳后銀染色結(jié)果詳見圖2。

圖2 糞腸球菌和屎腸球菌GyrA的PAGE電泳圖Fig.2 GyrA gene electrophoresis pattern for E.faecalis and E.faecium

2.3 基因測序

對有異常電泳條帶的糞腸球菌和屎腸球菌擴增產(chǎn)物進行測序，用 NCBI中的 Blast軟件與基因庫(Genbank)中的相應基因序列進行對比分析顯示，糞腸球菌的87位密碼子發(fā)生改變:GAA變?yōu)镚GA，密碼子編碼對應的氨基酸由谷氨酸變?yōu)楦拾彼帷Ｊ耗c球菌的83位密碼子改變:AGT變?yōu)門AT，密碼子編碼對應的氨基酸由絲氨酸變?yōu)楦彼帷?/p>

2.4 利血平對糞腸球菌多重耐藥泵的抑制試驗

利血平對腸球菌多重耐藥泵具有抑制作用，M-H瓊脂中加入利血平可以提高環(huán)丙沙星對腸球菌的敏感性，實驗結(jié)果詳見表1。

表1 M-H瓊脂加入利血平后30株糞腸球菌MIC下降的倍數(shù)Tab.1 30 strains E.faecalis MIC reduction level when M-H agar containing reserpine

3 討論

40株對左氧氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥腸球菌(30株糞腸球菌，10株屎腸球菌)和糞腸球菌ATCC 29212均擴增出GyrA基因。經(jīng)過PCR-SSCP法檢測顯示其中24株糞腸球菌和4株屎腸球菌的單鏈泳動帶出現(xiàn)異常。對出現(xiàn)異常條帶的菌株進行測序分析，并將測序結(jié)果與ATCC29212和Genebank中相關(guān)菌株的基因序列進行比較，其中糞腸球菌在第87位上有密碼子改變:GAA變?yōu)镚GA，密碼子編碼的氨基酸由谷氨酸變?yōu)楦拾彼帷Ｊ耗c球菌在第83位有密碼子改變:AGT變?yōu)門AT，密碼子編碼的氨基酸由絲氨酸變?yōu)楦彼帷?/p>

40株腸球菌中有70%(28株)發(fā)生了基因突變，結(jié)果導致對氟喹諾酮類藥物的耐藥。文獻［4］報道氟喹諾酮類耐藥菌株的變異常發(fā)生于螺旋酶A亞單位的67～106位氨基酸，即耐氟喹諾酮類決定區(qū)(QRDR)，本次試驗所用引物擴增出的PCR產(chǎn)物包括QRDR，所有菌株均擴增出241bp的GyrA片段，經(jīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析后共電泳出3種帶型:糞腸球菌ATCC29212、對Levo和Cip敏感的糞腸球菌為一種帶型;耐藥菌株出現(xiàn)2種帶型，一種帶型為糞腸球菌的GyrA亞單位的87位氨基酸由谷氨酸變?yōu)楦拾彼?，?4株耐藥菌檢測到了該突變;另一種帶型為屎腸球菌的GyrA亞單位的83位氨基酸由絲氨酸變?yōu)楦彼幔?株耐藥菌檢測到了該突變。此外，糞腸球菌的耐藥程度雖然不同，但其GyrA的突變點一致。12株耐藥腸球菌并未發(fā)生基因突變，說明GyrA基因QRDR突變是腸球菌對氟喹諾酮類藥物耐藥的重要原因。利血平對腸球菌多重耐藥泵具有抑制作用，M-H瓊脂中加入終濃度為20 μg/mL的利血平后，30株糞腸球菌中有10株細菌的MIC值降為原來的一半，有4株細菌的MIC值降為原來的四分之一，腸球菌的敏感性在原有的水平上有了不同程度的提高。腸球菌GyrA基因突變和多重耐藥泵是其對氟喹諾酮類抗生素耐藥的主要原因。

［1］Gould I M.The epidemiology of antibiotic resistance［J］.Int J Antimicrob Agents，2008，32(Suppl 1):S2-9.

［2］汪玲，沈敘莊，陸權(quán)，等.4地兒科臨床分離革蘭陽性球菌2000-2006年耐藥性監(jiān)測［J］.首都醫(yī)科大學學報，2008，29(5):627-631.

［3］Wickman P A，Black J A，Smith Moland E，et al.In vitro development of resistance to DX-619 and other quinolones in enterococci［J］.J Antimicrob Chemother，2006，58(6):1268-1273.

［4］Piekarska K，Jaqielski M.Genetical conditioning of fluoroquinolone resistance mechanisms of clinical enterococcus faecalis strains.Ⅱ.The mutations present in the qrdrs of gypA，gyrB，parC and parE genes［J］.Med Dosw Mikrobiol，2007，59(4):329-341.

［5］盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學試驗技術(shù)［M］.2版.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2004，111-217.

［6］Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:nineteenth informational supplement.CLSI document M100-S19［S］.Wayne:CLSI，2009.