呂 虹 高志勇 張國(guó)軍 閆惠平 康熙雄*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷中心，100050;2.北京市疾病預(yù)防控制中心傳染病與地方病防治所，北京 100013;3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院感染與免疫中心，北京 100069)

人類杯狀病毒(human caliciviruses，HuCV)包括諾如病毒(norovirus，NVs)和札如病毒(sapovirus，SVs)，是導(dǎo)致人類急性非細(xì)菌性胃腸炎的常見(jiàn)病原體，也是僅次于輪狀病毒導(dǎo)致兒童急性腹瀉的重要病原體。長(zhǎng)期以來(lái)，由于檢測(cè)方法的局限，對(duì)HuCV給人類造成的危害及其嚴(yán)重程度缺乏正確的認(rèn)識(shí)，常常低估其危害。1992年以美籍學(xué)者Jiang X［1］為首的研究組建立并發(fā)展了RT-PCR方法檢測(cè)HuCV后，HuCV所致疾病的危害性和嚴(yán)重性越來(lái)越被研究者重視。有效的RT-PCR檢測(cè)的關(guān)鍵是找到可以用于RT-PCR擴(kuò)增的保守引物序列，并保證檢測(cè)的敏感性和特異性，目前，用于HuCV檢測(cè)的RT-PCR引物序列主要針對(duì)RNA多聚酶基因。由于HuCV病毒在糞便標(biāo)本中的含量較低，需要建立更敏感、更特異的檢測(cè)方法。同時(shí)傳統(tǒng)的RT-PCR方法操作繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)室和操作人員要求較高，容易引起結(jié)果假陽(yáng)性或假陰性，給疾病診斷帶來(lái)困難。因此本研究建立了一種檢測(cè)NVs的新方法，并以傳統(tǒng)RT-PCR方法為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)新方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，為NVs的檢測(cè)提供一種快速靈敏的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1)標(biāo)本來(lái)源:選取2007年2月至2007年3月北京市36家醫(yī)療機(jī)構(gòu)(二級(jí)以上醫(yī)院和區(qū)、市疾病預(yù)防控制中心)門(mén)診就診或住院的腹瀉患者364例，其中男性患者 202例，女性患者 162例，男女性別比1.25∶1。患者年齡從 ＜1歲至 79 歲，平均年齡(37.22±19.84)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《諾如病毒感染性腹瀉防治方案(試行)》［2］，患者均有腹瀉或嘔吐等臨床癥狀，每日排便次數(shù)≥3次，糞便性狀發(fā)生明顯改變(稀水樣、蛋花樣、黏液便或稀便等，無(wú)膿血)，糞便、血常規(guī)檢查無(wú)特殊發(fā)現(xiàn)，顯微鏡檢查排除常見(jiàn)細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等感染，懷疑病毒性胃腸炎。

2)收集方法:樣本采集便盒由北京市疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)一發(fā)放，無(wú)菌采便盒外包裹一層可開(kāi)啟的塑料袋。樣本均為發(fā)病3 d內(nèi)患者的糞便樣本，每份標(biāo)本量不少于5 mL，不得用肛拭子采集，標(biāo)本采集后要求立即低溫送檢，不能及時(shí)送檢的要求－20℃冰凍保存，標(biāo)本避免反復(fù)凍融。長(zhǎng)期保存樣本置于－80℃冰箱。

3)試劑來(lái)源:恒溫快速檢測(cè)諾如病毒試劑盒由日本東曹公司提供，諾如病毒提取試劑采用美國(guó)QIAGEN公司病毒核酸提取試劑盒(QIAamp?Viral RNA Mini Kit)，反轉(zhuǎn)錄體系采用Promega公司RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

4)引物:擴(kuò)增區(qū)域位于諾如病毒基因組ORF1，基因位點(diǎn)在nt 4 568～4 886之間(參考株序列號(hào)為M87661)。由北京市中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供［3］，見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR所用引物Tab.1 Primers used in RT-PCR

5)儀器設(shè)備:恒溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)由日本東曹公司提供，BIO-RAD擴(kuò)增儀，Eppendorf高速低溫離心機(jī)，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2 方法

1)樣本處理:糞便樣本從－80℃冰箱取出，室溫復(fù)融。將1 mL樣本稀釋液(來(lái)自DAKO公司諾如病毒ELISA 試劑盒)至1.5 mL Eppendorf管中，加入0.1 g固體糞便樣本或0.1 mL液體糞便樣本，置于漩渦振蕩器上混勻，室溫靜置10 min，室溫下5 500 r/min離心5 min，進(jìn)行檢測(cè)。

2)病毒RNA提取:病毒RNA提取采用美國(guó)QIAGEN公司病毒提取試劑盒。

3)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR):采用 Promega公司RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反應(yīng)體系:10×緩沖液2.5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，2.5 mmol/L dNTPs 5 μL，1%BSA 2.5 μL，0.2 μg/μL 引物 289 混合液 1 μL，10 U/μL AMV-RT 0.35 μL，50 U/μL RNase 0.1 μL，DEPC 處理 H2O 8.05 μL，模板 RNA 1.5 μL，總體積25 μL。輕微離心混勻，42℃反轉(zhuǎn)錄1 h。PCR反應(yīng)體系:10 × 緩沖液 5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，0.2 μg/μL 引物 289 混合液 1 μL，0.1 μug/μL 引物 290 混合液 1 μL，5 U/μL Taq酶0.4 μL，DEPC 處理 H2O 29.6 μL，cDNA 8 μL，總反應(yīng)體積50 μL。輕微離心混勻，放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件:94℃變性3 min，94℃ 1 min，58℃ 80 s，72℃ 1 min，循環(huán)30次，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

4)恒溫快速檢測(cè)方法:將試劑從－20℃冰箱取出，室溫復(fù)融。分別取10 μL試劑A和10 μL試劑B于0.5 mL PCR擴(kuò)增管中，再加入5 μL模板RNA，每批次反應(yīng)加陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。將反應(yīng)體系放入恒溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)中，43℃預(yù)熱5 min，同時(shí)將混合酶預(yù)熱3 min，將5 μL酶依次加入反應(yīng)體系中，進(jìn)行檢測(cè)。儀器通過(guò)1.3倍閾值判斷陰陽(yáng)性結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析結(jié)果，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，一致性分析采用Kappa系數(shù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)用TRC方法對(duì)病毒性胃腸炎患者進(jìn)行NVs核酸檢測(cè)的結(jié)果

TRC方法檢測(cè)諾如病毒，可以同時(shí)檢測(cè)NVs GGI型和NVs GGⅡ型，364例病毒性胃腸炎患者糞便樣本應(yīng)用TRC方法進(jìn)行檢測(cè)(表2)，NVs GGI型陽(yáng)性14例，占總檢測(cè)病例的3.85%(14/364)，陰性350例，占總檢測(cè)病例的96.15%(350/364);NVs GGⅡ型陽(yáng)性146例，占總檢測(cè)病例的40.11%(146/364)，陰性218例，占總檢測(cè)病例的59.89%(218/364)。

表2 不同型別諾如病毒應(yīng)用TRC方法檢出情況Tab.2 Different types of norovirus detection using TRC method

應(yīng)用TRC方法對(duì)病毒性胃腸炎患者糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)，NVs陽(yáng)性總數(shù)為160例，占總檢測(cè)病例的43.96%(160/364)。其中 NVs GGI占 8.75%(14/160)，NVs GGⅡ占91.25%(146/160)。

應(yīng)用TRC方法進(jìn)行諾如病毒檢測(cè)，可以通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光檢測(cè)信號(hào)觀察結(jié)果，檢測(cè)陽(yáng)性曲線如圖1所示。在146例諾如病毒2型陽(yáng)性的結(jié)果中，陽(yáng)性結(jié)果檢出時(shí)間顯示89.73%的結(jié)果小于20 min，在14例諾如病毒1型陽(yáng)性的結(jié)果中，陽(yáng)性結(jié)果檢出時(shí)間顯示78.58%的結(jié)果小于20 min。

恒溫檢測(cè)方法共檢測(cè)出陽(yáng)性數(shù)為160例，檢測(cè)陽(yáng)性率為43.96%(160/364)。其中男性患者檢出率為45.54%(92/202)，女性患者檢出率為 41.76%(68/162)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.465，P=0.495)。364例腹瀉病人樣本按年齡分組(表3)，其中陽(yáng)性率最高的為50歲 ～59歲組，其陽(yáng)性率為63.63%(35/55)，陽(yáng)性率最低的為10～19歲組，其陽(yáng)性率為18.93%(5/26)，通過(guò)χ2檢驗(yàn)，除10～19歲組檢出率低于各組外，其余各組間檢驗(yàn)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.704，P=0.069)。

表3 364例腹瀉患者NVs檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Test results of norovirus determination in 364 sporadic cases of acute viral gastroenteritis

2.2 TRC方法與RT-PCR方法檢測(cè)病毒性腹瀉患者糞便樣本中的核酸結(jié)果比較

RT-PCR方法檢出結(jié)果同TRC方法進(jìn)行比較(表4)，兩種方法檢測(cè)雙陽(yáng)性為139例，雙陰性為191例，另外有34份樣本兩種方法檢測(cè)結(jié)果不一致，其中TRC檢測(cè)方法陽(yáng)性但是RT-PCR檢測(cè)方法結(jié)果陰性有21份，用RT-PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性而TRC方法檢測(cè)陰性的為13份。

以RT-PCR為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算TRC方法的敏感度、特異性等指標(biāo)如下:

敏感度Se=a/(a+c)=139/(139+13)=91.45%;

圖1 諾如病毒檢測(cè)陽(yáng)性曲線Fig.1 Positive curve for detection of norovirus NVs:norovirus.

表4 TRC方法與RT-PCR方法的檢測(cè)結(jié)果Tab.4 Test results of TRC and RT-PCR

特異度Sp=d/(b+d)=191/(21+191)=90.09%;

總的符合率π=(a+d)/(a+b+c+d)=(139+191)/(139+21+13+191)=90.66%;

比數(shù)積OP=Se/(1－Se)*Sp/(1－Sp)=ad/bc=139*191/21*13=97.25;

陽(yáng)性預(yù)測(cè)值PV+=a/(a+b)=139/(139+21)=86.88%;

陰性預(yù)測(cè)值PV－=d/(c+d)=191/(13+191)=93.63%。

這兩組檢驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)配對(duì)χ2檢驗(yàn)，P=0.229，說(shuō)明兩組陽(yáng)性檢出率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即兩種實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果無(wú)差異。通過(guò)一致性檢驗(yàn)結(jié)果顯示Kappa=0.809，P=0.000，可見(jiàn)這兩種試驗(yàn)方法結(jié)果一致性極佳。

3 討論

NVs屬于HuCV科中諾如病毒屬，病毒直徑約為26～35 nm，無(wú)包膜，表面粗糙，球形，呈二十面體對(duì)稱;NVs基因組是單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約7 642 nt。諾如病毒家族成員龐雜，目前已對(duì)其100多個(gè)分離株進(jìn)行基因測(cè)序。核酸的同源性分析表明，世界不同地區(qū)、不同時(shí)間流行的諾如病毒基因RNA多聚酶區(qū)序列相對(duì)保守，核苷酸氨基酸序列同源性高于60%，有的達(dá)到90%以上。因此，根據(jù) RNA多聚酶區(qū)核苷酸序列的相似性，將諾如病毒分為5個(gè)遺傳組(genogroups，GG)，其中感染人的包括 GGⅠ、Ⅱ和Ⅳ。GGⅠ組也可感染豬，GGⅢ和GGⅤ組分別感染牛和鼠。NVs除了分5個(gè)遺傳組外還分29個(gè)基因型，其中GGⅠ組有8個(gè)，GGⅡ組有17個(gè)，GGⅢ組2個(gè)，GGⅣ組有1個(gè)，GGⅤ組有1個(gè)。其中GGⅡ/4型是傳播最廣的基因型，中國(guó)以及世界上絕大多數(shù)胃腸炎的暴發(fā)疫情都是由GGⅡ/4型引起的［4-6］。由于NVs不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，也沒(méi)有合適的動(dòng)物模型，因此對(duì)其研究受到制約，檢測(cè)方法的進(jìn)展研究緩慢。目前用于檢測(cè)該病毒的方法主要有電鏡法、免疫學(xué)檢測(cè)和分子檢測(cè)等，這些檢測(cè)方法是分別基于病毒外形特點(diǎn)、主要抗原決定簇和特異性核酸序列而建立的。1972年美國(guó)科學(xué)家Kapikian A Z等［7］就是通過(guò)免疫電鏡的方法發(fā)現(xiàn)NVs，因此該方法在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)成為檢測(cè)NVs的經(jīng)典方法。此方法對(duì)操作者的技能和經(jīng)驗(yàn)要求很高，沒(méi)有得到廣泛的推廣。RT-PCR方法特異性好、靈敏度高，能檢測(cè)到10～40拷貝的病毒核酸。20世紀(jì)90年代以來(lái)，研究者們分別成功地運(yùn)用RT-PCR的方法對(duì)感染者糞樣中的NVs核酸進(jìn)行了檢測(cè)，設(shè)計(jì)引物對(duì)RNA多聚酶基因相對(duì)保守的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了較高的陽(yáng)性率。直至今日，RT-PCR方法仍是檢測(cè)NVs的常用方法。本研究中RT-PCR方法所用引物為針對(duì)HuCV RNA多聚酶區(qū)而設(shè)計(jì)的P289/P290混合引物，此方法檢出率高［8-11］，對(duì)于NVs的擴(kuò)增產(chǎn)物為319 bp，SVs的擴(kuò)增產(chǎn)物為331 bp，2者由于片段大小接近，很難用瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分，需通過(guò)測(cè)序分析鑒定。

本研究所采用的TRC方法是一種帶熒光標(biāo)記的實(shí)時(shí)監(jiān)控恒溫?cái)U(kuò)增方法，引物設(shè)計(jì)位于 ORF1和ORF2的交界區(qū)。在43℃條件下，利用INAF熒光探針對(duì)目標(biāo)RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。應(yīng)用TRC方法檢測(cè)病毒性胃腸炎患者糞便樣本中NVs核酸檢出率為43.96%(160/364)，略高于 RT-PCR 方法(41.76%)。以RT-PCR方法為標(biāo)準(zhǔn)，TRC方法，敏感度91.45%，特異度90.09%，總的符合率為90.66%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值86.88%，陰性預(yù)測(cè)值93.63%。通過(guò)配對(duì) χ2檢驗(yàn)和Kappa檢驗(yàn)，兩種方法結(jié)果之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)，一致性極佳。

此外，TRC方法可以同時(shí)檢測(cè)NVs GGI和NVs GGⅡ，無(wú)需經(jīng)過(guò)克隆測(cè)序分型，快速、簡(jiǎn)便、靈敏、經(jīng)濟(jì)，適合臨床和疾控部門(mén)推廣使用。

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