譚和平，葉德萍，沈興中，唐祥凱，王 智

（中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院，四川 成都 610021）

0 引言

美國(guó)3M公司研究生產(chǎn)的PetrifilmTM菌落總數(shù)測(cè)試片是目前普遍采用的成熟的微生物快速檢測(cè)方法，獲得了AOAC官方方法的認(rèn)可、認(rèn)證，我國(guó)將此方法用于檢測(cè)食品中菌落總數(shù)，并將其列入出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 1897-2007）[1]。3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測(cè)試片為預(yù)先制備好的平板培養(yǎng)基系統(tǒng)，含有標(biāo)準(zhǔn)的平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、冷水可溶性凝膠和特異性的指示劑[2]。目前，國(guó)際上統(tǒng)一使用的ISO/IEC 17025:2005《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》中，強(qiáng)調(diào)了檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室在適當(dāng)時(shí)應(yīng)對(duì)測(cè)量結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)定。而當(dāng)前報(bào)道3M PetrifilmTM法檢測(cè)菌落總數(shù)不確定度評(píng)定的文獻(xiàn)較少[3]。為此，該文對(duì)3M PetrifilmTM法測(cè)定生活飲用水菌落總數(shù)的測(cè)量結(jié)果不確定度進(jìn)行了評(píng)定，以期為從事相關(guān)測(cè)試和研究的機(jī)構(gòu)及人員提供參考。1 材料及方法

1.1 試劑及材料

0.85%生理鹽水由實(shí)驗(yàn)室自己配制，3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測(cè)試片由3M中國(guó)有限公司提供。樣品來(lái)源于綿陽(yáng)、德陽(yáng)、都江堰等地生活飲用水。

1.2 檢測(cè)方法

以無(wú)菌操作方法吸取1mL充分混勻的水樣，注入盛有9 mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻成1∶10稀釋液。吸取1∶10的稀釋液1mL注入盛有9mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻成1∶100稀釋液。按同法可依次稀釋成 1∶1000，1∶10000 稀釋液等備用。

1.2.2 3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測(cè)試片法[1]

將測(cè)試片置于平坦桌面揭開(kāi)上層膜，吸取1mL適宜稀釋度的稀釋液垂直滴加在測(cè)試片中央處，上層膜落下后，用壓板輕輕壓上層膜中央處，使樣液均勻覆蓋于培養(yǎng)面上；拿起壓板，靜置，每個(gè)稀釋度接種2張測(cè)試片；培養(yǎng)基凝固后置（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h，計(jì)數(shù)紅色菌落數(shù)。

2 不確定度評(píng)定

2.1 不確定度來(lái)源

3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測(cè)試片檢測(cè)生活飲用水中菌落總數(shù)不確定度的來(lái)源主要包括重復(fù)性、逐級(jí)稀釋及取樣、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等。

該實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱的溫度均勻度為0.6℃，溫度波動(dòng)度為0℃/30min，溫度偏差為0.5℃。實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)溫度設(shè)定為36℃，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，參照SN/T 1897-2007培養(yǎng)溫度為（36±1）℃，培養(yǎng)時(shí)間為（48±2）h，說(shuō)明溫度和培養(yǎng)時(shí)間在規(guī)定范圍內(nèi)波動(dòng)對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響可忽略。因此，只考慮重復(fù)性、逐級(jí)稀釋及取樣對(duì)菌落總數(shù)的影響。

2.2 逐級(jí)稀釋及取樣引入的不確定度

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別使用了1mL微量移液器和10mL吸管，移取體積分別為1mL和9mL。1mL微量移液器的容量允許誤差為±1.0%[4]，按均勻分布處理；10mL吸管為A級(jí)，容量允許誤差為±0.05 mL[5]，按三角分布處理，則校準(zhǔn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

稀釋及取樣不確定度為[6]

陸游《游臥龍寺》一詩(shī)描述他追隨夔州的峒民“曉發(fā)魚(yú)復(fù)走瞿唐”，游觀當(dāng)?shù)厝苏J(rèn)為最宏大的臥龍寺，結(jié)果卻令他十分失望：“過(guò)江走馬十五里，小寺殘僧真蕞爾。投鞭入門一為笑，僻陋稱雄有如此?！敝杂X(jué)得其寒酸簡(jiǎn)陋，是因?yàn)殛懹我?jiàn)過(guò)家鄉(xiāng)所在的吳越地區(qū)更為壯觀的寺廟：“君不見(jiàn)天童、徑山金碧浮虛空，千衲梵唄層云中”。故鄉(xiāng)佛教建筑的雄偉，標(biāo)志著吳越地區(qū)經(jīng)濟(jì)、宗教的發(fā)達(dá)，而夔州，僅從一個(gè)小寺廟就可見(jiàn)其各方面的貧窮落后。

式中：x——稀釋及取樣過(guò)程中取1mL的次數(shù)；

y——稀釋及取樣過(guò)程中取9mL的次數(shù)。

稀釋10倍所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3 重復(fù)性引入的不確定度

重復(fù)性測(cè)量分為單一樣品的重復(fù)測(cè)量和多個(gè)樣品的重復(fù)測(cè)量?jī)煞N情況。由于微生物測(cè)量結(jié)果的發(fā)散性較大，直接根據(jù)測(cè)量結(jié)果計(jì)算重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度欠妥，通常將測(cè)量結(jié)果取對(duì)數(shù)后再進(jìn)行計(jì)算。該實(shí)驗(yàn)菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果取對(duì)數(shù)后，經(jīng)夏皮羅-威爾克法檢驗(yàn)為正態(tài)分布，可以直接使用A類不確定度計(jì)算方法。所以，兩種方法均對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)取對(duì)數(shù)值后再用常規(guī)的貝塞爾方法進(jìn)行計(jì)算。

2.3.1 單一樣品重復(fù)測(cè)量結(jié)果的不確定度評(píng)定

對(duì)某一水源水使用3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測(cè)試片重復(fù)測(cè)量10次，結(jié)果及不確定度的計(jì)算過(guò)程見(jiàn)表1[7]。

表1 單一樣品重復(fù)測(cè)量結(jié)果不確定度的計(jì)算過(guò)程

（1）合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。測(cè)量結(jié)果為10次重復(fù)測(cè)量的平均值，故平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）擴(kuò)展不確定度。95%置信概率下取包含因子k=2，則測(cè)量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為

2.3.2 多個(gè)樣品測(cè)量結(jié)果的不確定度評(píng)定

對(duì)多個(gè)樣品每個(gè)樣品測(cè)2次平行的情況可采用合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差的方式對(duì)測(cè)量結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)定[8]。該文對(duì)30個(gè)生活飲用水中菌落總數(shù)結(jié)果不確定度的計(jì)算見(jiàn)表2和表3。

（1）標(biāo)準(zhǔn)不確定度。由每個(gè)試樣的殘差平方和計(jì)算30個(gè)樣品的合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差，得到

每個(gè)試樣測(cè)量2次，2次測(cè)量的平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

30個(gè)樣品中部分樣品是取原液得到的菌落總數(shù)，僅取樣引入的不確定度為0.005 8，可以忽略不計(jì)。稀釋10倍的樣品在稀釋和取樣過(guò)程中引入的不確定度為0.0085，稀釋100倍的樣品在稀釋和取樣過(guò)程中引入的不確定度為0.0106，相對(duì)于菌落計(jì)數(shù)測(cè)量結(jié)果的發(fā)散程度引起的不確定度來(lái)說(shuō)，相差數(shù)十倍以上，可以忽略不計(jì)，因此，只考慮重復(fù)測(cè)量引入的不確定度。

表2 30個(gè)樣品測(cè)量結(jié)果及不確定度計(jì)算過(guò)程(未檢出細(xì)菌的樣品未列出)

表3 30個(gè)樣品不確定度計(jì)算過(guò)程

（2）擴(kuò)展不確定度。取置信概率p=95%，自由度ν=m（n-1）=30，由 t分布表可得 k=2.745，于是擴(kuò)展不確定度為

3 結(jié)束語(yǔ)

3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測(cè)試片法測(cè)定生活飲用水中菌落總數(shù)，其測(cè)量不確定度的主要來(lái)源由重復(fù)性引入，B類不確定度分量對(duì)合成不確定度貢獻(xiàn)較小。由于微生物測(cè)量結(jié)果的發(fā)散性較大，一般采用取對(duì)數(shù)后計(jì)算不確定度。對(duì)單一樣品重復(fù)測(cè)量多次的情況，可通過(guò)求算數(shù)平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度來(lái)求檢測(cè)結(jié)果的不確定度；對(duì)多個(gè)樣品每個(gè)樣品測(cè)平行的情況，可通過(guò)求合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差求檢測(cè)結(jié)果的不確定度，而且有了新的檢測(cè)結(jié)果，還可隨時(shí)加入到合并樣本中，重新計(jì)算合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差，更新其不確定度的取值范圍。

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