楊玉燕，王 曉，孫 瑜，于宗淵

(1.山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南250355;2.山東省分析測試中心，山東 濟南250014;3.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟南250014)

木蘭屬植物望春花Magnolia biondii Pamp.的干燥花蕾為中藥辛夷的主要來源。辛夷為辛溫解表類常用中藥，有散風寒、通鼻竅的功能，用于風寒頭痛、鼻塞流涕、鼻淵等［1］。文獻報道，望春花蕾中主要含有揮發(fā)油類、木脂素類等成分，具有多種生理活性，包括抗過敏、降壓、中樞抑制作用、抗菌、抗病毒、抗衰老等［2］。木蘭脂素是其中主要的木脂素類成分之一，其化學結構式見圖1，具有較強的抗炎、抗過敏作用［3］，并且對大鼠腎缺血再灌注損傷具有一定的保護作用［4，5］。目前報道的對望春花蕾化學成分的分離主要采用薄層色譜、硅膠柱色譜等傳統(tǒng)方法［6，7］。本文報道采用高速逆流色譜(HSCCC)對望春花蕾中的木蘭脂素進行分離，方法重現(xiàn)性好，適合于木蘭脂素的制備性分離。

圖1 木蘭脂素的化學結構式

1 儀器與材料

1.1 儀器 GS10A型高速逆流色譜儀(北京艾美林科技有限公司);TBP5002型雙柱塞恒流泵(上海同田生物技術有限公司);3057－11記錄儀(重慶川儀總廠有限公司);8823B－紫外檢測器(北京賓達英創(chuàng)新科技有限公司);Waters 600型高效液相色譜儀(美國Waters公司);Varian INOVA－600核磁共振波譜儀(美國Varian公司);Agilent 6320 ion－trap質譜儀(美國Agilent公司)。

1.2 材料 提取及分離用甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯等均為分析純(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑有限公司)，水為蒸餾水;HPLC分析用甲醇為色譜純(美國Tedia公司)，水為樂百氏純凈水。

望春花蕾購自陜西省安康市藥材公司，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院于宗淵研究員鑒定為木蘭屬植物望春花Magnolia biondii Pamp.的干燥花蕾。

2 方法與結果

2.1 提取及預分離 取望春花蕾粗粉，用95%乙醇加熱回流提取2次，提取液回收溶劑得浸膏，拌入適量硅藻土，裝柱，先后用石油醚、乙酸乙酯、甲醇洗脫，分別得到石油醚、乙酸乙酯、甲醇洗脫液。取乙酸乙酯洗脫液，回收溶劑得浸膏，備用。

2.2 兩相溶劑體系 本實驗所用溶劑體系為石油醚－乙酸乙酯 － 甲醇 － 水(5∶2∶3∶6，v/v)，按比例配置于分液漏斗中，劇烈震蕩使充分混合，于室溫靜置分層。分出上下相，使用前超聲脫氣15 min，備用。

2.3 分配系數(shù)的測定 取少量乙酸乙酯洗脫物置于試管中，加入上下相各3 mL，超聲處理，使樣品充分溶解，靜置分層，取上下相各5 μL，用HPLC進行檢測，得上相中目標化合物峰面積為A1，下相中目標化合物峰面積為A2，分配系數(shù)K=A1/A2。

2.4 樣品溶液的制備 稱取乙酸乙酯洗脫物180 mg，加入上下相各4 mL，超聲使其完全溶解，用于HSCCC分離。

2.5 HSCCC分離 將已超聲脫氣的上相(固定相)以20 mL·min－1流速泵入HSCCC螺旋管中，待上相充滿整個螺旋管后，緩慢調節(jié)主機轉速至800 r/min，順時針旋轉，轉速穩(wěn)定后，將下相以2 mL·min－1流速泵入，同時打開紫外檢測器，檢測波長254 nm，上下相平衡后，將樣品溶液注入HSCCC儀，打開記錄儀，根據(jù)色譜圖(見圖2)收集流分I，回收溶劑，得到30 mg化合物I。

圖2 乙酸乙酯洗脫物的高速逆流色譜圖(Ⅰ為接收流分)

2.6 HPLC分析 色譜柱:Inertsil ODS－SP(4.6 mm×250 mm，5 μm);柱溫:25 ℃;檢測波長:276 nm;流速:1.0 mL·min－1;流動相:甲醇 － 水(60∶40);進樣量:10 μL。

乙酸乙酯洗脫物及流分Ⅰ的HPLC圖分別見圖3和圖4。

圖3 乙酸乙酯洗脫物的HPLC圖譜

圖4 流分Ⅰ的HPLC圖譜

2.7 結構鑒定 化合物Ⅰ:無色晶體。UV λMeOHmaxnm:204.0，229.0，276.2。ESI－MS m/z:417［M+H］+。1H － NMR(600 MHz，CDCl3)δ:3.11(2H，m，H － 1/H － 5)，3.83，3.87，3.89(each，3H，s，OMe)，3.86(6H，s，OMe)，3.92，4.27(each 2H，m，H －4/H －8);4.75(2H，m，H －2/H －6)，6.67(2H，s，Ar－H)，6.91 － 6.97(3H，m，Ar－ H)。13C － NMR(75 MHz，CDCl3)δ:54.33(C － 1)，54.66(C － 5)，56.16(OMe)，56.42(OMe)，61.14(OMe)，72.05(C －4)，72.13(C －8)，85.90(C－2)，86.25(C －6)，102.85(C －2″/C －6″)，109.34(C －2')，111.15(C －5')，118.50(C －6')，133.60(C － 1')，137.04(C－1″)，137.72(C － 4″)，148.85(C － 3')，149.39(C － 4')，153.65(C －3″/C －5″)。以上數(shù)據(jù)與文獻［7］報道一致，故鑒定為木蘭脂素。

3 討論

高速逆流色譜是一種建立在特殊的流體動力學平衡基礎上的液－液分配色譜技術，它不使用固相載體作固定相，克服了傳統(tǒng)色譜中固相載體產(chǎn)生的樣品不可逆吸附、變性、損失、污染、樣品回收率低和峰形拖尾等缺點，現(xiàn)已被廣泛應用于天然產(chǎn)物的分離純化領域［8］。

高速逆流色譜法的應用中，最關鍵的問題是溶劑系統(tǒng)的選擇，不同的溶劑系統(tǒng)有不同的黏度、極性及密度，會對相同的成分產(chǎn)生不同的溶解分配能力進而影響K值和分離效果。本實驗根據(jù)所分離化合物的特性，觀察了目標化合物在三氯甲烷－甲醇－水和石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水等溶劑體系中的分離效果，結果表明，當采用石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水為兩相溶劑體系時，可實現(xiàn)目標化合物的分離。又對目標化合物在不同比例的石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水體系中的K 值進行了考察，當比例(v/v/v/v)分別為1∶1∶1∶1、5∶2∶3∶6、5∶2∶4∶5 時，K 值分別為 0.3、1.2、2.5，根據(jù)色譜理論，利用HSCCC分離樣品的必要條件是樣品在兩相中的分配系數(shù)必須在0.5和2.0之間，最好是1;若K≤1，樣品會很快隨流動相流出，達不到分離效果;若K≥1，樣品的出峰時間會延長，形成寬峰，因此最后確定比例為(5∶2∶3∶6，v/v)［9］。

本實驗還對流動相的流速進行了考察，當流速較低時，分離時間過長，峰形擴展，流速較大時，分離效果差，最后確定流速為2 mL·min－1，既節(jié)約時間和溶劑，又能達到良好的分離效果。

本實驗采用HSCCC法對望春花蕾中的木蘭脂素進行了分離，與常規(guī)柱色譜法相比，該法具有簡便、快速、節(jié)省溶劑、重現(xiàn)性好的特點，為望春花蕾中木蘭脂素的快捷制備提供了一種實用的方法。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:169－170.

［2］楊西曉，莊志銓.辛夷化學成分和藥理作用研究進展［J］.中草藥，1998，29(7):490 －492.

［3］李小莉，張永忠.木蘭脂素抗炎、抗過敏作用的實驗研究［J］.中草藥，2002，33(11):1014 －1015.

［4］李軍輝，王鋒，汪年松，等.木蘭脂素對腎缺血再灌注損傷大鼠P－選擇素表達的影響［J］.中國中西醫(yī)結合腎病雜志，2008，7，9(7):586 －588.

［5］李軍輝，王鋒，向海燕，等.木蘭脂素對腎缺血再灌注損傷大鼠Toll樣受體4表達的影響［J］.實用醫(yī)學雜志，2009，25(4):536 －538.

［6］Lu YH，Gao Y，Wang ZT，et al.A benzofuranoid neolignan from Magnolia biondii pamp［J］.J Chinese Pharmaceutical Sciences，2005，14(3):137 －139.

［7］郭群，方紅，蘇瑋.望春花中的木脂素類化學成分研究［J］.中草藥，2004，8，35(8):850 －852.

［8］曹學麗.高速逆流色譜分離技術及應用［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2005:16－20.

［9］Ito Y.Golden rules and pitfalls in selecting optimum condition for high－speed counter counter chromatography［J］.J Chromatogr A，2005，1065(2):145－168.