彭艷輝, 駱 劍, 尹紹武, 朱曉平, 胡 靜, 劉志亮, 祝 斐,齊興柱, 胡亞麗

(1. 海南大學(xué) 海洋學(xué)院, 海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海南 ?？?570228; 2. 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇 南京 210046)

波紋唇魚微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選及適用性分析

彭艷輝1, 駱 劍1, 尹紹武2, 朱曉平1, 胡 靜1, 劉志亮1, 祝 斐1,齊興柱1, 胡亞麗2

(1. 海南大學(xué) 海洋學(xué)院, 海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海南 海口 570228; 2. 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇 南京 210046)

采用磁珠富集法及利用生物素標(biāo)記的(CA)15寡核苷酸探針從波紋唇魚(Cheilinus undulatus)基因組 DNA Bsp143Ⅰ酶切位點(diǎn)的 400～1000 bp片段中篩選 CA/GT微衛(wèi)星位點(diǎn)。洗脫的雜交片段克隆到PMD18-T載體上構(gòu)建富集微衛(wèi)星基因組文庫后, 通過PCR篩選出陽性克隆進(jìn)行測序。在120條序列中有88條序列包含有重復(fù)次數(shù)不少于5次的微衛(wèi)星位點(diǎn), 陽性序列比例達(dá)到73.33%。其中完美型(perfect)類型微衛(wèi)星最多的重復(fù)次數(shù)為26次。在88條非冗長序列中, 共有28條(31.82%)微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端有側(cè)翼序列能夠進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。用波紋唇魚3個(gè)個(gè)體的混合基因進(jìn)行引物篩選, 其中的24對具有清晰的擴(kuò)增條帶。將篩選的24對引物對波紋唇魚1個(gè)群體的39個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析, 其中4對引物擴(kuò)增產(chǎn)物為單態(tài), 20對擴(kuò)增產(chǎn)物呈多態(tài)性; 20對擴(kuò)增多態(tài)的引物在39個(gè)個(gè)體中擴(kuò)增出等位基因數(shù)為2～12, 平均有效等位基因數(shù)為3.5。該波紋唇魚群體的PIC、Ho、He的平均值分別為0.0782、0.8513、0.5667。這20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)適于波紋唇魚群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究分析。

波紋唇魚(Cheilinus undulatus); 微衛(wèi)星分子標(biāo)記; 篩選; 磁珠富集法

波紋唇魚(Cheilinus undulatus), 俗稱蘇眉, 分類上屬硬骨魚綱(Osteichthyes), 鱸形目(Pereifomes),隆頭魚亞目(Labroidei), 隆頭魚科(Labridae), 唇魚屬(Cheilinus), 是一種大型的珊瑚礁魚類[1-2]。在世界范圍內(nèi), 波紋唇魚主要分布于非洲東岸、紅海以及印度洋至太平洋中心, 在中國主要分布在南海與東海的南部。波紋唇魚以其魚唇深受亞洲人喜愛, 僅僅幾年的時(shí)間, 波紋唇魚已瀕臨絕種, 被世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)、世界自然基金會(WWF)等組織和《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)列入瀕危物種名單[3-4]。國內(nèi)外對波紋唇魚的研究主要集中在地理分布、分類學(xué)、形態(tài)學(xué)鑒定、生態(tài)習(xí)性、繁殖和保護(hù)等方面[5-15],但未見對波紋唇魚種質(zhì)資源和遺傳多樣性的研究報(bào)道, 特別是在分子水平上, 目前還是空白。而了解波紋唇魚種群遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳分化對于該魚資源調(diào)查與人工繁殖是十分重要和基礎(chǔ)性的工作。

微衛(wèi)星標(biāo)記(Microsatellite, SSR)作為一種分子遺傳標(biāo)記, 具有分布廣、遺傳信息含量高、共顯性和便于 PCR檢測等優(yōu)點(diǎn)[16-17], 已成為魚類種質(zhì)資源保護(hù)、群體遺傳結(jié)構(gòu)、生物進(jìn)化、分類學(xué)研究最主要的手段, 已廣泛用于研究魚類遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系鑒定、品系家系鑒別、構(gòu)建遺傳連鎖圖譜和數(shù)量性狀定位[18-24]等方面。本研究開發(fā)、鑒定了波紋唇魚微衛(wèi)星分子標(biāo)記, 旨在為波紋唇魚及唇魚屬其他魚類的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)、種群的時(shí)空分布動力學(xué)等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

波紋唇魚群體的39個(gè)野生樣本采自南海海域。Bsp143I內(nèi)切酶購自 Fermentas公司, 磁珠購自Promega公司, T4DNA連接酶、質(zhì)粒pMD18-T載體購自TaKaRa公司, 大腸桿菌 (Escherichia coli) Top10感受態(tài)細(xì)胞、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生物科技(北京)有限公司; Linker AB、生物素標(biāo)記的(CA)15探針由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成, M13、RV由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 波紋唇魚總基因組DNA提取

采用常規(guī)“酚-氯仿”抽提法[25]提取波紋唇魚總基因組DNA, 測定DNA濃度, -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA酶切、膠回收和接頭連接

取波紋唇魚基因組DNA(約10μg)用Bsp143Ⅰ內(nèi)切酶在37℃酶切5 h。酶切產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳后, 用膠DNA回收試劑盒回收400～1000 bp的 DNA片段。將回收的片段與磷酸化接頭 Linker AB(表1)在16℃連接過夜。連接反應(yīng)體系20 μL, 含2 μL 10×Buffer T4DNA ligase, 1 μL T4酶, 0.3 μL磷酸化接頭Linker AB, 500～1000 ng酶切DNA片段。

表1 實(shí)驗(yàn)的接頭、引物及生物素探針Tab. 1 The sequence of primers, adaptors and biotin-labeled probes in the experiment

1.2.3 PCR擴(kuò)增和磁珠富集

以連接產(chǎn)物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL, 含 2.5 μL 10×PCR Buffer、1.5 μL 25 mmol/L MgCl2、1.5 μL 2.5 mmol/L dNTP、1U Taq DNA polymerase, 引物 Bsp143Ⅰ(A) 10 pmol, 2 μLDNA 連接產(chǎn)物。94℃預(yù)變性5 min 后, 15 個(gè)循環(huán), 每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30 s, 65℃退火45 s, 72℃延伸1 min。最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物以試劑盒回收, 并測定濃度。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與生物素標(biāo)記的(CA)15探針進(jìn)行雜交。將上一步收集到的DNA加dd2H2O至500 μL , 65 ℃水浴 10 min 后, 加入 1.5 μL 50 μmol/L BiotinX(CA)15探針, 13 μL 20×SSC Buffer, 混勻后靜置10 min。期間洗滌磁珠, 先吸去磁珠管中緩沖液,加入 0.5×SSC Buffer洗滌磁珠兩次。加入 500 μL DNA, 混勻, 吸出溶液, 存留。再以0.1×SSC Buffer洗滌磁珠4次。在磁珠管中加入100 μL ddH2O洗脫DNA并測定濃度。

以洗脫液為DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20個(gè)循環(huán), 每個(gè)循環(huán)包括 94℃變性 30 s, 56℃退火 30 s,72℃延伸1 min。最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物以試劑盒回收, 并測定濃度。

1.2.4 DNA片段克隆、篩選和序列測定

膠回收的目的DNA片段插入pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌Top10中。轉(zhuǎn)化的細(xì)菌37℃,100 r/min培養(yǎng)1 h后涂布到添加了IPTG和X-Gal的氨芐青霉素AMP LB平板上, 37℃培養(yǎng)12～15 h。挑取白色單菌落于LB培養(yǎng)基中, 150 r/min振蕩培養(yǎng)3～5 h。4℃作為PCR篩選的模板。

M13和RV被用來篩選陽性菌落。PCR反應(yīng)體系為 10 μL, 含 1.0 μL 10×PCR Buffer、0.8 μL 25 mmol/L MgCl2、0.5 μL 2.5 mmol/L dNTP、1U Taq DNA polymerase, 引物 M13, RV 各 10 pmoL, 0.5 μL DNA模板(菌液)。94℃預(yù)變性5 min后, 25個(gè)循環(huán), 每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30 s, 56℃退火40 s, 72℃延伸1 min。最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 篩選出片段＞500 bp且單一亮帶的菌液。以上一步篩選出的片段大于500 bp且單一亮帶的菌液為模板, 分別用M13/RV與(CA)15進(jìn)行2次篩選, 篩選出有單條亮帶的菌液, 送上海生物工程有限公司測序。

1.2.5 測序結(jié)果分析和統(tǒng)計(jì)

以軟件SSRHunter、Chroms、Jellyfish等對測序結(jié)果進(jìn)行微衛(wèi)星搜索、峰圖驗(yàn)證、載體去除等操作,最后按微衛(wèi)星的核心重復(fù)序列次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.6 引物設(shè)計(jì)

以軟件primer premier 5.0對非冗長微衛(wèi)星位點(diǎn)兩端均有＞150 bp的側(cè)翼序列的序列設(shè)計(jì)引物, 設(shè)計(jì)原則為： 退火溫度 50～60℃, GC 含量 45%～55%, 引物長度18～24, 產(chǎn)物預(yù)期長度50～300 bp。送上海生物工程有限公司合成。

1.2.7 引物篩選及特性的分析

用39個(gè)波紋唇魚樣本對合成的引物進(jìn)行檢測評估。觀測雜合度(Observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity,He)等由 PopGen32計(jì)算獲得, 多態(tài)信息含量(Average polymorphism information content, PIC)由PIC-CALC計(jì)算獲得。

2 結(jié)果

2.1 陽性克隆的篩選與測序

本研究共計(jì)挑取 697個(gè)單菌落, 以通用引物M13/RV和微衛(wèi)星核心序列引物(CA)15 對其進(jìn)行 2次PCR擴(kuò)增篩選, 得到132個(gè)陽性菌落, 測序, 共計(jì)獲得120個(gè)序列的測序結(jié)果。

2.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)的分析和引物設(shè)計(jì)

對120個(gè)測序結(jié)果以軟件SSRHunter查找, 共計(jì)獲得88個(gè)重復(fù)次數(shù)不少于5的微衛(wèi)星位點(diǎn)序列, 陽性序列達(dá)到 73.33%, 其中兩端側(cè)翼序列均＞150 bp的微衛(wèi)星位點(diǎn)序列有56個(gè), 占陽性序列的63.64 %。經(jīng)軟件Jellyfish的Alignments功能分析未發(fā)現(xiàn)冗長序列(同一序列測序兩次)。

根據(jù) Weber[26]的微衛(wèi)星重復(fù)序列分類原則, 88個(gè)微衛(wèi)星序列中各類型比例依次為完美型 69.32%,非完美型 7.95%, 復(fù)合型 22.73%, 其中完美型微衛(wèi)星序列最多重復(fù)次數(shù)為 26次(圖 1)。按核心序列重復(fù)次數(shù)統(tǒng)計(jì), 重復(fù)次數(shù)為5～10次的微衛(wèi)星序列有45條(占 51.14%), 11～15次的微衛(wèi)星序列有 20條(占22.73%), 16～20次的微衛(wèi)星序列有21條(占23.86%),重復(fù)序列在 20以上的有 2條(占 2.27%)。以軟件Primer primer 5.0設(shè)計(jì)引物, 共設(shè)計(jì)出引物28對, 引物命名與克隆編號相對應(yīng)(表2)。

圖1 波紋唇魚微衛(wèi)星大小分布Fig. 1 Microsatellite size distribution of C. undulatus

2.3 引物的篩選與評估

用波紋唇魚的基因組DNA 3個(gè)樣本, 對引物的擴(kuò)增條件, 包括 Mg2+濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行摸索, 確定最適合的 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件。結(jié)果顯示, 28對引物中有24對有較好的擴(kuò)增, 條帶清晰且重復(fù)性高, 4對引物(B4、A44、T258和T462)未能擴(kuò)增(表2)。然后用這24對引物對波紋唇魚39個(gè)樣本進(jìn)行擴(kuò)增。以8%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳結(jié)合銀染法[27]檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。如圖 2所示引物T462對39個(gè)波紋唇魚樣本擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性效果。

位點(diǎn) A137、B30(3)、T90、T282擴(kuò)增的條帶僅1條, 無多態(tài)性, 不做進(jìn)一步分析。其他20對引物共獲得70個(gè)有效等位基因, 從2到12不等, 平均數(shù)為3.5。觀測雜合度(Ho)的范圍為 0.2308～1.0000, 平均值為 0.8513, 期望雜合度(He)的范圍為0.2068～0.8442, 平均值為 0.5667, 多態(tài)性信息含量(PIC)范圍為 0.1833～0.8160, 平均值為 0.4733(表 3)。根據(jù) Bostein等[28]等提出的理論, 位點(diǎn) B22、A67、A75、A106、A112、A120、T462屬于高度多態(tài)性位點(diǎn); 位點(diǎn) A18、A3、A63、A65、A66、A101、A119、A148、A151、B30、B30(2)、T63屬于中度多態(tài)性位點(diǎn); 位點(diǎn) T302屬于低度多態(tài)性位點(diǎn)。由此, 可以認(rèn)為該波紋唇魚群體為中高度多態(tài)性群體, 遺傳多樣性比較豐富。

3 討論

3.1 微衛(wèi)星的篩選

目前, 對于沒有充足基因組序列信息物種的微衛(wèi)星篩選主要采用小片段克隆法(快速 PCR法)和文庫富集法兩種方法[28-31]。文庫富集方法相對于小片段克隆法具有方法步驟簡單、減少了非目的片段, 篩選效率高、篩到的微衛(wèi)星數(shù)目多的優(yōu)勢, 簡略了構(gòu)建文庫與篩選文庫的過程[32]。本研究采用生物素探針—磁珠富集法, 并結(jié)合2次PCR擴(kuò)增法篩選微衛(wèi)星位點(diǎn), 直接用菌液作為模板, 更是大大提高了微衛(wèi)星篩選的精確性。本實(shí)驗(yàn)所測的序列分析表明, 相當(dāng)比例的微衛(wèi)星側(cè)翼序列較短(88個(gè)含微衛(wèi)星位點(diǎn)的序列中有32個(gè)出現(xiàn)此現(xiàn)象, 比例達(dá)36.36%), 無法篩選到合適的的引物。作者認(rèn)為發(fā)生該現(xiàn)象的原因有兩個(gè)方面： (1)可能與本實(shí)驗(yàn)內(nèi)切酶在基因組的酶切位點(diǎn)有一定關(guān)系, 可以嘗試改變酶切體系的方法來改善; (2)文庫富集法相對于小片段克隆法, 由于所插入載體的DNA片段長度小, 也可能導(dǎo)致此現(xiàn)象。

表2 28對微衛(wèi)星引物篩選結(jié)果及其特性Tab. 2 Screen results and characterization of 28 primers

圖2 波紋唇魚T462基因位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Analysis of PCR products for locus T462 in C. undulatus1～39. 波紋唇魚個(gè)體1-39. C. undulatus individuals

表3 波紋唇魚20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特征Tab. 3 PCR products and characteristics for 20 microsatellite loci in C. undulatus

3.2 微衛(wèi)星的檢測

動物中微衛(wèi)星DNA以CA/GT重復(fù)最豐富[33-35],因此, 本實(shí)驗(yàn)采用(CA)15為探針。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 每100個(gè)克隆可以得到近8個(gè)微衛(wèi)星序列, 得率比較高,可以認(rèn)為波紋唇魚基因組中含有豐富的CA/GT重復(fù)序列。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)使用的是(CA)15探針, 所以, 檢測出微衛(wèi)星序列多為(CA/GT)n重復(fù), 另還檢測到少量的CT/AG 重復(fù)(如位點(diǎn) A63、位點(diǎn) B30)以及個(gè)別的GTCT、ATCT重復(fù)。本研究所得完美型的微衛(wèi)星占大多數(shù)(69.32%), 這與鯉(Cyprinus carpio)[36]、劍尾魚(Xiphophorus helleri)[37]等魚類的微衛(wèi)星的情況相類似。所獲得的微衛(wèi)星序列重復(fù)次數(shù)幾乎都在5～20次,這與青石斑魚(Epinephelus awoara)[38]、勒氏笛鯛(Lutjanus russelli)[39]、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)[40]等魚類的微衛(wèi)星序列重復(fù)次數(shù)情況相似,也與 Ellegren[41]對微衛(wèi)星序列重復(fù)次數(shù)分析結(jié)果是一致的。

3.3 引物適用性分析

本研究設(shè)計(jì)的28對引物, 24對有較好的擴(kuò)增效果, 經(jīng)8%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳篩選后, 得到20對可用于波紋唇魚的遺傳分析, 引物的可用性比較高。另外4對引物(B4、A44、T258和T457)沒能產(chǎn)生穩(wěn)定擴(kuò)增產(chǎn)物, 作者認(rèn)為原因可能有2種情況： 一是與引物的質(zhì)量有關(guān), 如引物T258可能本身的質(zhì)量就不夠理想; 二是與重復(fù)序列的連續(xù)重復(fù)次數(shù)有關(guān),重復(fù)單元連續(xù)重復(fù)次數(shù)過多可能會導(dǎo)致擴(kuò)增的不穩(wěn)定性, 影響擴(kuò)增的效果, 如B4、A44和T457。這與龔小玲等[42]研究澳洲鰻鱺(Anguilla australis)的微衛(wèi)星引物適用性分析的原因是一樣的。本研究開發(fā)的微衛(wèi)星位點(diǎn)及引物在今后的波紋唇魚的群體遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等方面都會起到一定的作用, 進(jìn)而為波紋唇魚的種質(zhì)資源保護(hù)提供理論依據(jù), 為其可持續(xù)開發(fā)利用提供科學(xué)指導(dǎo)。而且, 本研究所開發(fā)的波紋唇魚的微衛(wèi)星引物也可以嘗試被用于隆頭魚科其他屬近緣種魚類的研究。

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Screening and suitability analysis of microsatellite markers in Cheilinus undulatus

PENG Yan-hui1, LUO Jian1, YIN Shao-wu2, ZHU Xiao-ping1, HU Jing1,
LIU Zhi-liang1, ZHU Fei1, QI Xing-zhu1, HU Ya-li2
(1. The Ocean College of Hainan University, Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Hainan University,Ministry of Education, Haikou 570228, China; 2.College of Life Sciences,Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China)

Feb.,9, 2011

Cheilinus undulatus; microsatellite molecular markers; screening; magnetic-bead enrichment method

Genomic DNA of Cheilinus undulatus was digested by restriction endonuclease Bsp143Ⅰand electrophored on agarose gel. The DNA fragments from 400 to 1000 bp were recovered and ligated to Bsp143Ⅰadaptor.Purified and adaptor ligated fragments were hybridized to biotin-labelled (CA)15probe and captured by Streptavidin-coated magnetic beads. Target fragments were eluted, and PCR amplified, then the purified PCR products were inserted to PMD18-T vector and transformed into Top 10 component cell. Positive clones in the enriched genomic DNA bank were screened out through PCR method and sequenced. Of 120 positive clones, 88 sequences contained repetition that repeated no less than 5 times, none redundant sequences were found after the multiple sequence alignment analysis, and the 88 non-redundant microsatellite-contained sequences, of which about 73.33%contained positive sequence, and the largest repeat number of perfect type microsatellite was 26. Among the 88 non-redundants,28 (or 31.82%) had enough flanking region (＞150 bp), which is enough to design microsatellite primer pairs. 28 primer pairs were synthesized and tested with the compound DNA of 3 C. undulatus individuals. 24 loci were produced with clear bands. A population of 39 individuals were tested with the 24 loci. 20 loci revealed polymorphic,while 4 loci was monomorphic. The primer pairs amplified the loci with relatively high numbers of alleles ranging from 2 to 12 with an average of 3.5 per locus among 20 ploymorphic loci. The polymorphism information content (PIC), observed heterozygosity (Ho) and expected heterozygosity (He) were 0.0782, 0.8513, and 0.5667, respectively. The 20 ploymorphic loci could be useful for the analysis of population structure from C. undulatus.

Q31

A

1000-3096(2012)05-0109-08

2011-02-09;

2011-05-10

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(40966003); 海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(809009); “十一五”國家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)資助項(xiàng)目(2007BAD29B03)

彭艷輝(1985-), 女, 湖南衡東人, 碩士研究生, 主要從事

魚類種質(zhì)資源與遺傳育種研究, E-mail： pyh221100@163.com; 尹紹武,通信作者, 教授, E-mail： yinshaowu@163.com

(本文編輯：譚雪靜)