郭雪潔, 路延篤, 張 蕾, 姜 鵬, 秦 松

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院 煙臺(tái)海岸帶研究所, 山東 煙臺(tái) 264003;3. 中國(guó)科學(xué)院 青島生物能源與過(guò)程研究所, 山東 青島 266101; 4. 中國(guó)科學(xué)院 研究生院, 北京 100049)

萊茵衣藻FAB2的原核表達(dá)以及不同脅迫條件下的表達(dá)模式

郭雪潔1,4, 路延篤2,3, 張 蕾2,4, 姜 鵬1, 秦 松1

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院 煙臺(tái)海岸帶研究所, 山東 煙臺(tái) 264003;3. 中國(guó)科學(xué)院 青島生物能源與過(guò)程研究所, 山東 青島 266101; 4. 中國(guó)科學(xué)院 研究生院, 北京 100049)

脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase)是不飽和脂肪酸合成途徑的關(guān)鍵酶, 催化脂肪酸鏈的特定位置脫氫形成雙鍵, 其通過(guò)引入雙鍵調(diào)節(jié)脂肪酸不飽和度, 以適應(yīng)周?chē)h(huán)境的變化。萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)質(zhì)體?；??；d體蛋白去飽和酶(plastid acyl-ACP desaturase, FAB2)在Δ9位脫氫, 催化脂肪酸中第1個(gè)雙鍵的形成。本文首先在大腸桿菌中異源表達(dá)了FAB2, 另外將其氨基酸序列與其他高等植物、微藻、真菌等進(jìn)行了多序列比對(duì)以及系統(tǒng)進(jìn)化分析, 推測(cè)其與高等植物親緣關(guān)系更近。利用定量 RT-PCR技術(shù)研究了衣藻 FAB2基因不同脅迫條件下的表達(dá)模式, 結(jié)果表明4 ℃ +0%NaCl, 25 ℃ +1%NaCl 脅迫條件下FAB2基因表達(dá)量都有一定程度升高。

萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii); ?；??；d體蛋白去飽和酶; 表達(dá); 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

不飽和脂肪酸在生物體的生命活動(dòng)中占有重要地位, 動(dòng)物、植物和微生物等的膜脂中都含有特定的不飽和脂肪酸, 它是機(jī)體生物膜的重要組成成分,對(duì)生物膜結(jié)構(gòu)、機(jī)能、相轉(zhuǎn)變、通透性的調(diào)節(jié)及相關(guān)過(guò)程的調(diào)控有重要作用。并且, 它參與細(xì)胞生物化學(xué)反應(yīng)、轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng), 影響脂肪代謝、尋靶作用、免疫反應(yīng)、耐寒、抗氧化等生理過(guò)程。此外, 不飽和脂肪酸還是哺乳動(dòng)物體內(nèi)生成前列腺素、凝血啞烷和白三烯等激素的前體, 具有提高人體免疫力、預(yù)防心血管疾病和癌癥等重要的生理功能[1]。多不飽和脂肪酸具有極其重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值, 微藻是多不飽和脂肪酸的初級(jí)生產(chǎn)者, 但常溫下含量極低,通過(guò)分子生物學(xué)的方法改造微藻,有望提高多不飽和脂肪酸的含量。多不飽和脂肪酸(PUFA) 在微藻中的合成是以飽和脂肪酸如硬脂酸為底物, 通過(guò)一系列脫飽和酶(Desaturase, DS) 和延長(zhǎng)酶(Elongase, EL) 的催化作用形成的, 脂肪酸去飽和酶是PUFA 合成途徑的關(guān)鍵酶[2]。

脂肪酸去飽和酶能夠在脂肪酸的烴鏈上引入雙鍵, 存在于幾乎所有生物中, 其在維持生物膜正確的結(jié)構(gòu)和功能方面具有重要作用[3]。根據(jù)脂肪酸結(jié)合的載體不同可分為 3類(lèi)： (1)酰基脂去飽和酶(acyl-lipid desaturase)只在糖脂結(jié)合態(tài)的脂肪酸中引入不飽和鍵, 是一類(lèi)膜蛋白, 存在于植物葉綠體、真核微藻和原核藍(lán)藻。(2)?；?酰基載體蛋白去飽和酶(acyl-ACP desaturase)只在?；d體蛋白(ACP)結(jié)合態(tài)的脂肪酸中引入雙鍵, 主要存在于植物細(xì)胞質(zhì),以可溶的形式存在。 (3)酰基-輔酶 A 去飽和酶(acyl-CoA desaturase)在輔酶A 結(jié)合態(tài)的脂肪酸中引入不飽和鍵, 是一種膜蛋白, 存在于動(dòng)物、真菌、酵母[4]。Δ9去飽和酶(簡(jiǎn)稱(chēng)Δ9DES或Δ9D)催化脂肪酸中第一個(gè)雙鍵的形成, 是不飽和脂肪酸生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶, 都以鐵為輔因子, 在藍(lán)藻中又稱(chēng)為DesC。其功能是催化 16∶0-ACP 和 18∶0-ACP 轉(zhuǎn)化為 16∶1(Δ9)-ACP 和 18∶1(Δ9)-ACP[5]。有人已分別從 Synechocystis sp.、Synechocystis PCC 6803、Spirulina platensis 這 3種藍(lán)藻中克隆到基因序列,都屬于酰基脂去飽和酶。另外, Nishizaki等[6]也從A.nidulans 中克隆了Δ9去飽和酶基因desC。它可以與多種膜脂的C16 和C18碳脂肪酸作用,形成Δ9位雙鍵。將desC基因轉(zhuǎn)入煙草植株,轉(zhuǎn)基因植株膜脂中單不飽和脂肪酸含量隆低。植株暴露于1℃達(dá)7 d 或者種子在10℃萌發(fā)并生長(zhǎng)70 d 都沒(méi)有任何受傷癥狀。這說(shuō)明煙草的抗寒性能在表達(dá)了Δ9去飽和酶后大為提高。衣藻CC503 FAB2是一種質(zhì)體?；?酰基載體蛋白脂肪酸去飽和酶, 理論上可以將 18∶0-ACP轉(zhuǎn)化為18∶1(Δ9)-ACP, 在多不飽和脂肪酸的生物合成途徑中引入第一個(gè)雙鍵, 是多不飽和脂肪酸生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶。

在高等植物或藻類(lèi)中都存在一些應(yīng)對(duì)逆境的途徑, 其中就包括脂肪酸介導(dǎo)的抵御外界脅迫的途徑[7-14]。在微藻的光合膜中, 脂肪酸的不飽和水平?jīng)Q定著膜脂的相轉(zhuǎn)變溫度, 即不飽和程度越高, 膜的相轉(zhuǎn)變溫度越低[15]。外界環(huán)境因素(如溫度、鹽度、光照等)正是通過(guò)某些分子機(jī)理來(lái)調(diào)節(jié)脂肪酸去飽和酶的表達(dá)和活性的, 通過(guò)調(diào)節(jié)去飽和酶的酶量和活性, 就能夠改變膜脂的不飽和度, 從而使細(xì)胞得以迅速改變脂肪酸的組成來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化。很多研究結(jié)果表明外界環(huán)境中的溫度、光照、活性氧濃度、氧化還原電位、N/P比、鹽度等因素對(duì)微藻生長(zhǎng)和脂肪酸的組成有顯著影響。脂肪酸去飽和酶及其基因克隆、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展, 理論上為進(jìn)一步研究溫度、鹽度等外界因素調(diào)節(jié)去飽和酶表達(dá)的模式, 明確微藻低溫適應(yīng)等的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

為了闡述衣藻 CC503FAB2是否在衣藻適應(yīng)低溫、高鹽環(huán)境時(shí)發(fā)揮作用, 本文在測(cè)定相應(yīng)脅迫條件下衣藻脂肪酸組成和含量變化的之后, 進(jìn)一步運(yùn)用Real-time PCR技術(shù)研究衣藻FAB2不同溫度、鹽度脅迫條件下的表達(dá)模式來(lái)幫助闡述這一過(guò)程。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藻株和培養(yǎng)方法

萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC503,購(gòu)自美國(guó) Chlamydomonas Genetic Center of Duke University。衣藻 CC503接種于 TAP (Tris-acetatephosphate)培養(yǎng)基[16],于 25℃光照條件下靜止培養(yǎng),光照強(qiáng)度2 000 lx , 光/暗周期為12h/12h。

1.1.2 菌種與質(zhì)粒載體

菌種： 大腸桿菌菌株 TOP10, Escherichia coli BL21 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

載體： T-A克隆載體pMD18-T載體購(gòu)自TAKARA公司, 表達(dá)載體pET-28a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 儀器設(shè)備與試劑

儀器設(shè)備： PCR儀(Tpersonal), 德國(guó)Biometra公司; 電泳儀(PAC300), 美國(guó)Bio-Rad公司; 凝膠成像分析系統(tǒng)(ImageMaster VDS) , 日本 FuJiFilm公司;常/低溫臺(tái)式離心機(jī)(Labofuge300/ Biofuge Stratos);ABI 7500 Fast Real-Time PCR 儀(ABI)。

試劑： T-A 克隆載體連接試劑盒, TaKaRa(大連)有限公司; 凝膠回收試劑盒, 上海飛捷(Fastagen)生物技術(shù)有限公司; Taq酶(TaKaRa公司); TRizol Reagent(Invitrogen公司); 反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit Perfect Real Time (TaKaRa);Real-time PCR 試劑盒 SYBR?Premix Ex TaqTMII(Perfect Real Time), TaKaRa; 10×DNaseI Buffer、RNase-inhibitor、DnaseI 均購(gòu)自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 萊茵衣藻總 RNA 的提取、RT-PCR 法克隆FAB2cDNA片段

1.2.1.1 萊茵衣藻總RNA的提取

采用 Trizol法提取總 RNA, 具體操作如下： 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的新鮮藻細(xì)胞, 4, 5℃ 000 r/min 離心8min,收集藻體, 液氮速凍后加入到液氮充分預(yù)冷的研缽中, 添加液氮充分迅速研磨材料成粉末。將材料轉(zhuǎn)移至DEPC處理過(guò)的1.5 mL離心管中, 加入1 mL Trizol, 室溫靜置3 min; 然后加入200 μL 氯仿, 蓋緊EP管, 劇烈振蕩15 s后, 室溫孵育3 min; 4, ℃12 000 r/min 離心15 min, 上清轉(zhuǎn)入新的離心管中,加入等體積的異丙醇, 顛倒混勻, 室溫靜置 15min;4, 12℃ 000 r/min 離心15 min, 棄上清, 用700 μL 75%乙醇洗沉淀一次, 4, 12℃ 000 r/min 離心5 min; 室溫下晾干后溶入適量的DEPC處理的水中(約20 μL),于－70 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 DNaseI處理消化基因組DNA

用 RNase-free DNaseI 消化總 RNA 樣品中的DNA, 按順序加入每一種試劑, 總反應(yīng)體積為 20μL。依次加入： 總 RNA(3 μg/μL)16 μL, 10× DNaseI buffer 2 μL, RNase-free DNaseI(1 U/μL)1 μL, RNase Inhibitor(40 U/μL)1 μL,37℃下溫浴 20 min。加入終止buffer 2. 5μL, 80 ℃處理 2 min, 于－70 ℃儲(chǔ)存。

1.2.1.3 cDNA第一鏈的合成

cDNA第一鏈的合成采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒。反應(yīng)體系如下： 5×PrimeScriptTMBuffer 2 μL, PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5 μL, Oligo dT Primer(50μmol/L)0.5μL, Random 6 mers(100 μmol/L)0.5 μL,Total RNA 6.5 μL, RNase Free dH2O補(bǔ)齊。輕甩混合上述體系, 并快速離心, 37 ℃溫育15 min, 85 ℃處理5 s,－20 ℃可保存3個(gè)月以上。

1.2.1.4 RT-PCR法克隆FAB2cDNA片段

根據(jù)NCBI上公布的萊茵衣藻CC503 FAB2 的cDNA序列, 設(shè)計(jì)特異性引物(引物由上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成)： 上游引物 fab2-F(5′-CAGGATCCCATATGGCTCTGGGCCAGCAGG-3′)和 下 游 引 物 fab2-R (5′-CCCAAGCTTTTACAGGGCCACCTCGCGG-3′), 分別包含 BamHI 和 HindIII酶切位點(diǎn)。以上一步合成的cDNA為模板PCR擴(kuò)增FAB2cDNA 片段。25 μL PCR 體系中含 10×Buffer 2.5μL, dNTP mix 0.5 μL, cDNA 模板為 1 μL,上下游引物各 1 μL,ddH2O 18.7 μL, Taq 酶(5U/μL)0.3 μL。反應(yīng)條件為： 94℃預(yù)變性5 min, 然后94 ℃ 30 s, 56 ℃30 s, 72 ℃ 1 min30s, 30個(gè)循環(huán), 最后72 ℃延伸7 min。取40 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收特異性擴(kuò)增片段, 并克隆至 pMD18-T 載體中,挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定?；A(chǔ)的分子生物學(xué)操作參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)[17]。

1.2.2 萊茵衣藻 FAB2基因原核表達(dá)載體構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)

將測(cè)序鑒定正確的 pMD18-T-fab2 質(zhì)粒用BamHI 和 HindIII 雙酶切, 將目的基因亞克隆至pET-28a(+) 載體上。將重組的原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后, 挑取單個(gè)菌落接種5 mL LB培養(yǎng)基(Amp+)中, 37 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3 h 后(A值大約為0.5左右), 加IPTG至終濃度為1 mmol/L, 37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。IPTG 誘導(dǎo)不同時(shí)間(1、2、3、4、5、6 h)收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.3 序列分析

1.2.3.1 氨基酸序列分析

利用 NCBI網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上的BLAST工具進(jìn)行基因序列的相似性及同源性查找, 將目的基因氨基酸序列與其他真核藻類(lèi)及高等植物的采用ClustalW[18]軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析,進(jìn)而進(jìn)行基因同源性的比較。此外, 根據(jù)其氨基酸序列,運(yùn)用在線(xiàn)工具進(jìn)行序列分析。采用在線(xiàn) HNN網(wǎng)站(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page =npsa_nn. html) 進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析, 采用在線(xiàn)Prot Param (http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html)網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)基本物理化學(xué)參數(shù)分析。

1.2.3.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

獲取NCBI中同種類(lèi)不同物種的FAB2基因采用ClustalW軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析,然后利用MEGA 4.0[19]軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生和進(jìn)化的分析。系統(tǒng)樹(shù)采用NJ法(Neighbour-Joining)方法構(gòu)建。

1.2.4 萊茵衣藻FAB2不同脅迫條件下表達(dá)模式研究

1.2.4.1 不同培養(yǎng)條件下衣藻生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期相同藻量的衣藻于100 mL新鮮TAP培養(yǎng)基中, 待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(A750=0.4～0.5)時(shí), 轉(zhuǎn)入各不同誘導(dǎo)條件(25℃ + 0%Na Cl,15℃ + 0%Na Cl, 4 ℃ + 0%Na Cl, 25 ℃ +0.5%NaCl, 25℃+1%NaCl)下分別進(jìn)行培養(yǎng), 而后測(cè)定一段時(shí)間內(nèi)不同生長(zhǎng)條件下衣藻的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.4.2 不同脅迫條件下萊茵衣藻 FAB2實(shí)時(shí)熒光定量

接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期相同藻量的衣藻于 50mL新鮮TAP培養(yǎng)基中, 待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD750=0.4～0.5)時(shí), 分別轉(zhuǎn)入各不同誘導(dǎo)條件(25 ℃ + 0%NaCl,15℃ + 0%Na Cl, 4 ℃ + 0%Na Cl, 25 ℃ +0.5%NaC l, 25℃+1%NaCl)下誘導(dǎo)36 h后收集藻體(每個(gè)條件下5個(gè)平行)。液氮中速凍10min, 放入－80℃冰箱中保存。提取不同條件誘導(dǎo)下樣品的RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA(具體方法參見(jiàn)1.2.1)。設(shè)計(jì)衣藻FAB2基因的上游引物RT-FAB2F： 5′-CTCAACACCCTGGACGGC-3′和下游引物 RT-FAB2R： 5′-GGTAGGGGTTGTTCTCGGTC-3′, 內(nèi)參 actin 上游引物 RT-actinF： 5′- GCAGTAGGAGGCATAGGGTT-3′和下游引物 RT-actinR： 5′-TCATCATCCTCCGTCGTTAG-3′。采用 SYBR Green I 染料法在熒光定量 PCR儀上采用 ABI 7500 Fast Real-Time PCR System 標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行擴(kuò)增, 對(duì)上述不同誘導(dǎo)條件下FAB2基因表達(dá)量進(jìn)行分析。20 μL的 PCR反應(yīng)體系中含有： SYBR?Premix Ex TaqTMII(2×)10.0 μL, PCR Forward Primer(10μ)0.8 μL, PCR Reverse Primer(10μm)0.8 μL, ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL, cDNA 模板 2.0 μL, dH2O(滅菌蒸餾水)6.0 μL, 總共為 20.0 μL。

采用兩步法 PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序, 數(shù)據(jù)分析根據(jù)公式ΔCT = CT(Target)- CT(Actin),取每份樣品5個(gè)重復(fù)樣的平均CT值計(jì)算目的基因FAB2相對(duì)于內(nèi)參基因actin的ΔCT值, 采用常用的2－Ct△△法[20]計(jì)算目的基因衣藻FAB2在不同脅迫條件下的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的克隆及驗(yàn)證

根據(jù)根據(jù) NCBI上已公布的衣藻 CC503FAB2的cDNA序列, 設(shè)計(jì)特異性引物通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增出了與預(yù)期大小基本一致的DNA條帶, 大小約為1206bp。切膠回收該片段, 將其與pMD18-T載體連接。挑選陽(yáng)性克隆, 菌液 PCR檢測(cè), 提取質(zhì)粒酶切檢測(cè)均為陽(yáng)性。送交測(cè)序結(jié)果也與預(yù)期相符。

2.2 萊茵衣藻FAB2基因的原核表達(dá)

將測(cè)序鑒定正確的pMD18-T-fab2質(zhì)粒用BamHI和HindIII 雙酶切, 將目的基因亞克隆至pET-28a(+)載體上。圖1顯示含重組質(zhì)粒的單克隆細(xì)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間后的表達(dá)狀況, SDS-PAGE 電泳結(jié)果檢測(cè)到大約在分子量45 kD 處明顯有1條表達(dá)量很高的蛋白條帶。圖中箭頭指向a即表達(dá)的目的蛋白。

圖1 衣藻FAB2基因原核表達(dá)粗蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 1 SDS-PAGE of crude protein extracts of FAB2 expressed in E.coli BL21 strainM. 蛋白質(zhì)Marker(自上而下分別是： 116.0, 66.2, 45.0, 35.0, 25.0 kD); 1.未經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)的 pET-28a-fab2 的表達(dá);2、3、4、5、6、7分別為經(jīng) 0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo) 1、2、3、4、5、6h 的 pET-28a-fab2的表達(dá); 8為空載體pET-28a(+)轉(zhuǎn)化BL21菌后的表達(dá)M： Protein molecular weight marker(from the top： 116.0, 66.2, 45.0,35.0, 25.0 kD); 1： Expression of pET-28a-fab2 not induced by IPTG;2、3、4、5、6、7： Expression of pET-28a-fab2 induced by 0.5 mmol/L IPTG for1、2、3、4、5、6 h; 8： Expression of pET-28a(+)

2.3 與其他真核藻類(lèi)及高等植物的多序列比對(duì)分析

氨基酸多序列比對(duì)(圖 2)發(fā)現(xiàn), 序列之間的同源性較高, 在連續(xù)多個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)多個(gè)氨基酸一致的情況。萊茵衣藻FAB2基因的氨基酸序列與團(tuán)藻(Volvox carteri f. nagariensis)、雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)、木油桐(Vernicia montana)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)基因的氨基酸序列同源性分別為83%、71%、59%、59%(圖2)。

2.4 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用在線(xiàn) HNN 數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)對(duì)萊茵衣藻 FAB2氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。萊茵衣藻FAB2基因蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明是由其大量分布在整個(gè)蛋白內(nèi)的 α-螺旋結(jié)構(gòu)、大量的無(wú)規(guī)則卷曲和少量擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)組成, 含α-螺旋189個(gè), 占47.13%; 擴(kuò)展鏈31個(gè), 占7.73%; 無(wú)規(guī)卷曲181個(gè), 占45.14%;

2.5 編碼蛋白的生化特性分析

采用在線(xiàn) Prot Param(http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html)網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)基本物理化學(xué)參數(shù)分析。

萊茵衣藻 FAB2基因編碼蛋白中各種氨基酸數(shù)量及比例顯示： 其中含有48個(gè)帶負(fù)電的氨基酸殘基(Asp + Glu), 占總數(shù)的11.9%; 46個(gè)帶正電的氨基酸殘基(Arg + Lys), 占總數(shù)的11.4%。經(jīng)推算該蛋白的分子質(zhì)量約為 44709.9 kD, 理論等電點(diǎn)為 6.65。在E. coi l中的半衰期大于10 h, 穩(wěn)定系數(shù)為28.88, 屬于穩(wěn)定的蛋白質(zhì)類(lèi)型。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

作者對(duì)比了來(lái)自不同物種的21個(gè)Δ9-acyl-ACP脂肪酸去飽和酶基因的氨基酸序列, 并利用MEGA4軟件對(duì)這些基因進(jìn)行了分子系統(tǒng)學(xué)分析, 據(jù)此構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)研究了衣藻 FAB2基因與其他物種基因之間的進(jìn)化關(guān)系。從(圖 3)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中可以看到,衣藻FAB2與幾種真核綠藻聚成一個(gè)分支, 介于細(xì)菌和高等植物之間, 但序列比對(duì)顯示衣藻的FAB2與高等植物的同源性更高, 揭示其在進(jìn)化上可能與高等植物有更近的親緣關(guān)系。

2.7 不同培養(yǎng)條件下萊茵衣藻生長(zhǎng)曲線(xiàn)

在光照強(qiáng)度等其他培養(yǎng)條件一致的情況下,25℃ + 0%Na Cl, 15℃ +0%NaCl, 4℃+0%NaCl, 25℃+0.5%NaCl, 25 ℃ + 1%NaCl五種不同培養(yǎng)條件下萊茵衣藻的生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖4所示。

萊茵衣藻在不同培養(yǎng)條件下的平均生長(zhǎng)速率不同, 由實(shí)驗(yàn)所繪制的生長(zhǎng)曲線(xiàn)可知,正常生長(zhǎng)條件25℃ + 0%Na Cl下, 萊茵衣藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率最快。其他培養(yǎng)條件下衣藻的生長(zhǎng)速率均有所減緩, 但又不至于脅迫細(xì)胞致死(在衣藻耐受范圍內(nèi))。因此設(shè)置以上溫度、鹽度梯度對(duì)萊茵衣藻進(jìn)行誘導(dǎo), 以25℃ + 0%Na Cl下培養(yǎng)的衣藻作為對(duì)照, 研究目的基因表達(dá)量的變化。

圖2 萊茵衣藻FAB2 與其他真核藻類(lèi)及高等植物氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig. 2 Amino acid sequences of FAB2 in comparison with the microsomal homologs from other plantsChlamydomonas reinhardtii(CrFAB2)、 Volvox carteri f. nagariensis(VcFAB2)、 Haematococcus pluvialis(HpSACP)、 Vernicia montana(VmSACP)、Arabidopsis thaliana(AtFAB2)

2.8 萊茵衣藻 FAB2不同脅迫條件下的表達(dá)特征

目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量按 Livak和 Schmittgen的方法計(jì)算[20]。根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)得到的CT 值(熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)), 計(jì)算出目標(biāo)基因FAB2和內(nèi)參基因actin CT 值的差異△CT; 進(jìn)而以差異最大的樣本作為參照樣本, 計(jì)算出不同樣品相對(duì)于參照樣本基因表達(dá)倍數(shù)2-△△CT, 從而制作出相對(duì)定量的圖表(圖5)。

由圖5中可以看出, 與正常生長(zhǎng)條件25℃+0%NaCl相比, 目的基因 FAB2在 15 ℃ + 0%Na Cl、25 ℃ + 0.5%Na Cl條件下相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有明顯變化,而在4 ℃ + 0%Na Cl、25 ℃ + 1%NaCl條件下表達(dá)量均有一定程度的升高, 但表達(dá)量的增加很小, 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示與對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異。說(shuō)明FAB2基因的表達(dá)確實(shí)受到溫度、鹽度的影響, 但可能不是在響應(yīng)該刺激過(guò)程中起最關(guān)鍵作用的基因。

圖3 來(lái)自不同物種的Δ9-acyl-ACP 脂肪酸去飽和酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig. 3 Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of Δ9-acyl-ACP desaturase homologous genesof different species

圖4 衣藻在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig. 4 The growth curve of C. reinhardrtii at different temperature and salinity stresses

3 討論

本文選取模式生物萊茵衣藻來(lái)研究?；??；d體蛋白脂肪酸去飽和酶基因的相關(guān)特性及不同條件下表達(dá)特征。首先將克隆到的衣藻 FAB2的 cDNA序列的編碼區(qū)連接到原核表達(dá)載體上, 將該基因在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá), 蛋白條帶大小與預(yù)測(cè)的相符。衣藻FAB2基因的原核表達(dá)為后續(xù)研究該基因編碼蛋白的活性(體內(nèi)活性及體外活性)奠定了基礎(chǔ)。衣藻屬于綠藻, 在現(xiàn)存的所有單細(xì)胞真核藻類(lèi)中, 綠藻是與陸生植物親緣關(guān)系最近的一支[21]。本文系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果也表明, 衣藻的FAB2基因與高等植物的該基因同源性更高, 提示其與高等植物有更近的親緣關(guān)系。另外, 很多研究表明溫度、鹽度等外界條件會(huì)在一定程度上影響到脂肪酸去飽和酶的表達(dá)。為了探究不同脅迫誘導(dǎo)條件下衣藻 FAB2基因的轉(zhuǎn)錄譜, 本實(shí)驗(yàn)選取不同溫度、鹽度梯度為誘導(dǎo)條件,使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR手段檢測(cè)發(fā)現(xiàn)： 與正常生長(zhǎng)條件25 ℃+0%Na Cl相比, 目的基因在15℃ + 0%NaCl、25 ℃ + 0.5%NaCl條件下相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有明顯變化, 而在 4 ℃ + 0%NaCl、25 ℃ + 1%Na Cl誘導(dǎo)條件下表達(dá)量均有一定程度的升高, 但升高程度也非特別顯著, 分析存在以下原因： 實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的該溫度、鹽度梯度尚不足以充分說(shuō)明問(wèn)題, 還應(yīng)進(jìn)一步降低溫度、提高鹽度(在衣藻生長(zhǎng)可耐受范圍內(nèi))重復(fù)該研究; 亦或是因?yàn)樵谌R茵衣藻響應(yīng)溫度、鹽度刺激時(shí), 本文所研究的衣藻FAB2基因并非起關(guān)鍵作用的基因, 也可能存在其他關(guān)鍵脂肪酸去飽和酶基因或其他基因。本研究初步說(shuō)明溫度、鹽度影響到了衣藻FAB2基因的表達(dá), 即該基因在衣藻應(yīng)答不同溫度、鹽度外界環(huán)境刺激時(shí)起了一定作用, 但可能不是響應(yīng)該刺激的最關(guān)鍵基因。也說(shuō)明了萊茵衣藻逆境適應(yīng)過(guò)程的復(fù)雜性, 具體的作用機(jī)制有待深入研究。

圖5 衣藻FAB2不同溫度、鹽度脅迫下(36 h)的相對(duì)表達(dá)量Fig. 5 Relative expression quantity of FAB2 from Chlamydomonas reinhardtii in responseto temperature and salinity changes

多不飽和脂肪酸(PUFA)是機(jī)體生物膜的重要組成成分, 對(duì)維系和調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常生物學(xué)功能起著重要的作用, Δ9-desaturase又是多不飽和脂肪酸合成途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶, 環(huán)境因素(如溫度、光照等)正是通過(guò)某些分子機(jī)理來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)去飽和酶的表達(dá)及其活性調(diào)控,使細(xì)胞得以迅速改變脂肪酸的組成來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化。本文對(duì)萊茵衣藻 FAB2基因不同溫度、鹽度下表達(dá)模式的研究, 理論上為明確微藻低溫適應(yīng)、高鹽適應(yīng)的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ), 同時(shí)對(duì)進(jìn)一步開(kāi)展其他脂肪酸去飽和酶的研究提供了示例。

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Heterologous expression of acyl-ACP desaturase (FAB2) from Chlamydomonas reinhardi in Escherichia coli and its expression features in response to different temperature and salinity stresses

GUO Xue-jie1,4, LU Yan-du2,3, ZHANG Lei2,4, JIANG Peng1, QIN Song1
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2.Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China; 3. Qingdao Institute of BioEnergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China; 4.Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Nov.,5,2011

Chlamydomonas reinhardtii ; acyl-ACP desaturase; expression; quantitative real-time PCR

Fatty acid desaturases are enzymes that introduce double bonds into the hydrocarbon chains of fatty acids. The expression of genes for desaturase is very important since it provides the molecular basis for the acclimation of organisms to changing environment. The plastid acyl-ACP desaturase(FAB2) from Chlamydomonas reinhardi is a kind of Δ9 desaturase, which catalyses the formation of a double bond between the ninth and tenth carbon in the fatty acid chain. In this paper, acyl-ACP desaturase (FAB2) From C. reinhardi was heterologous expressed in Escherichia coli. Homologous annlysis indicated that amino sequence of FAB2 is quite similar to those homologies from plants. The expression levels of FAB2 from C. reinhardi cells which under different temperature and salinity stresses were relatively analysised by using fluorescent quantitative real-time PCR technology. Results showed that the expression quantity of FAB2 during 4℃+0%NaCl, 25℃+1%NaCl were much higer than that of normal situations.

Q943.2

A

1000-3096(2012)05-0034-08

2011-11-05;

2012-03-22

國(guó)家 863計(jì)劃資助項(xiàng)目(2009AA10Z106); 中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新方向項(xiàng)目(KZCX2-YW-209); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(40876082)

郭雪潔(1986-), 女, 山東聊城人, 碩士, 主要從事藻類(lèi)功能基因研究, 電話(huà)： 0532-82898863, E-mail： xuejie.ll@163.com; 秦松,通信作者, 研究員, E-mail： sqin@yic.ac.cn

(本文編輯：梁德海)