張 雯, 王宏偉, 趙 丹, 盛英文, 欒日孝

(1. 遼寧師范大學 生命科學學院, 遼寧 大連 116029; 2. 大連自然博物館, 遼寧 大連 116023)

海南新紀錄種東方蜈蚣藻(紅藻門)的形態(tài)學觀察和rbcL基因序列分析

張 雯1, 王宏偉1, 趙 丹1, 盛英文1, 欒日孝2

(1. 遼寧師范大學 生命科學學院, 遼寧 大連 116029; 2. 大連自然博物館, 遼寧 大連 116023)

通過形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察、生殖器官的發(fā)育和rbcL序列分析相結(jié)合的方法, 發(fā)現(xiàn)了分布于海南省陵水新村的東方蜈蚣藻(Grateloupia orientalis S.-M. Lin et H.-Y.Liang)為海南新紀錄種, 該物種具有以下特征： 藻體質(zhì)地凝膠狀或軟骨質(zhì); 皮層外部由5～6層念珠狀的細胞構(gòu)成, 內(nèi)部由1～2層星形細胞構(gòu)成; 生殖枝叢由兩個分枝組成; 果孢子囊分布在除藻體基部外的皮層內(nèi)。

海膜科(Halymeniaceae); 東方蜈蚣藻(Grateloupia orientalis S.-M. Lin et H.-Y.Liang); 新紀錄種;形態(tài)學觀察; rbcL

蜈蚣藻屬(Grateloupia C.Agardh)隸屬于紅藻門(Rhodophyta)隱絲藻目(Cryptonemiales)海膜科(Halymeniaceae), 由 C.Agardh在 1822年基于Grateloupia ornata C.Agardh, G. hystrix C.Agardh和G. filicina (Lamouroux) C.Agardh這3種建立的,是海膜科最大的一個屬[1]。屬模為 G.filicina(Lamouroux) C.Ag., 主要特征是藻體直立,淡紅黃色或紫紅色, 黏滑或軟骨質(zhì), 多軸構(gòu)造。分為皮層和髓部, 中央髓部由縱走髓絲錯綜交織著,外圍皮層由圓形、橢圓形或不規(guī)則細胞組成, 背斜排列。有性藻體雌雄同體或異體, 精子囊群由雄配子體的外皮層細胞形成, 圓柱狀, 無色。果孢枝與輔助細胞分別由雌配子體的內(nèi)皮層細胞產(chǎn)生的枝絲中形成。成熟囊果埋于皮層中, 成顆粒狀, 突出于藻體表面。四分孢子囊由孢子體的外皮層細胞形成, 十字形分裂[2]。蜈蚣藻屬廣泛分布于世界各地的沿海, 全世界報道有約80種[3-10], 中國共報道32種[2]。

作者對海南沿海蜈蚣藻屬資源調(diào)查時, 對采自海南陵水新村的編號為 LNU092102和 LNU092103的標本進行了形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和 rbcL基因序列分析,發(fā)現(xiàn)與2008年林繡美等[11]報道的產(chǎn)自臺灣林園的新種東方蜈蚣藻(G. orientalis S.-M. Lin et H.-Y.Liang)完全一致, 由于在海南省為首次發(fā)現(xiàn), 因此確認該種為海南新紀錄種。

1 材料與方法

1.1 形態(tài)學觀察

材料采自海南省陵水新村。分別制作成臘葉標本、10%福爾馬林溶液液浸標本和硅膠干燥標本, 用于形態(tài)觀察、制作冰凍切片和DNA提取。其中, 冰凍切片用 0.5% (w/v)的甲基藍染色, 并用 Olympus BH2數(shù)字顯微鏡觀察, 用Nikon HFX-ⅡA照相機拍照記錄結(jié)果。標本保存于遼寧師范大學生命科學學院植物標本室中(LNU)。

1.2 分子序列分析

DNA的提取、PCR擴增以及引物設(shè)計參照Wang等[4]并改進的方法。引物組合方式為： (1)F8—R1381-ii, (2)F1—R1150, F735—R1381-ii(表 1)。

從 GenBank 網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)下載并選取了16個物種的基因序列進行rbcL序列分析(表 2), 包括 14個蜈蚣藻屬(Gratelouopia)的物種, 2個外群物種(Halymenia floresia, Polyopes constrictus)。MEGA 4.0軟件用于進行堿基差異度的分析以及系統(tǒng)樹的構(gòu)建, Bootstrap值為 1000。采用Kimura的雙參數(shù)法計算距離矩陣[12], 采用NJ(Neighbor-Joining)法和 MP(Maximum Parsimony)法構(gòu)建系統(tǒng)樹。

表1 rbcL序列擴增所需引物Tab. 1 Primers used for amplifying rbcL sequences

表2 rbcL序列分析所用海藻種類和基因庫編號列表Tab. 2 The species used for rbcL sequence analysis and gene number list

2 結(jié)果

2.1 藻體外部形態(tài)

藻體深紅色或棕色, 凝膠狀或軟骨質(zhì), 由 1～15個圓柱狀或亞圓柱狀的主枝組成, 高達16 cm, 基部具圓餅狀的固著器, 直徑2～7 mm。單生或數(shù)個集生在一起, 集生藻體的固著器緊密連接在一起。主枝長5～12 cm, 常為亞圓柱狀, 直徑 0.7～1.5 mm×2～3 mm,具有不規(guī)則的羽狀分枝, 分枝長 8～20 mm, 直徑0.2～0.3 mm×0.3～1.5 mm, 配子體和四分孢子體是同型的(圖1a和圖1b)。

圖1 東方蜈蚣藻Fig. 1 External morphology of G.orientalisa. 雌配子體(LNU092102); b. 四分孢子體(LNU092103)a. Female gametophyte (LNU092102); b. Tetrasporic plant (LNU092103)

2.2 內(nèi)部結(jié)構(gòu)

幼體和成熟藻體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)有細微的變化。幼枝內(nèi)部中空, 髓絲松散排列, 外皮層由四到五層念珠狀的細胞構(gòu)成(圖2a)。隨著分枝直徑的增加, 外皮層細胞經(jīng)縱向和橫向的分裂, 成為六到八層細胞, 髓絲伸長并緊密纏繞在一起, 由次生紋孔聯(lián)系相連接。

圖2 東方蜈蚣藻的橫切面結(jié)構(gòu)和生殖結(jié)構(gòu)(ac代表輔助細胞)Fig. 2 Transverse section and reproductive structures of G. orientalis.(The ac is auxiliary cell )a. 雌配子體橫切面觀; b～c. 輔助細胞生殖枝叢切面觀; d～e. 囊果的發(fā)育; f～g. 正在分裂的四分孢子; h. 成熟的四分孢子囊a. Cross-section through a branchlet female gametophyte; b～c. Lateral view of mature auxiliary cell ampulla; d～e. Developing cystocarp;f～g. Dividing tetrasporangium; h. Fully developed tetrasporangium

2.3 生殖結(jié)構(gòu)

果孢枝和輔助細胞生殖枝叢分別始于基部和近基部的內(nèi)皮層(圖 2b)。輔助細胞原始生殖枝叢橫向分裂形成一個長達三個細胞的長度的枝絲, 果孢枝和輔助細胞生殖枝叢繼續(xù)分裂并向外皮層延伸。當原始生殖枝叢達到 5～6個細胞的長度, 次生生殖枝叢的第一個細胞擴大, 行使輔助細胞的功能。受精后, 受精卵核通過聯(lián)絡(luò)絲從果孢枝生殖枝叢發(fā)出,到輔助細胞。果孢枝和輔助細胞生殖枝叢在外形上相同。一個完整發(fā)育的輔助細胞生殖枝叢有兩個分枝, 每個分枝可達 7～10個細胞的長度(圖 2b和圖2c)。

輔助細胞接受了受精卵核后, 經(jīng)橫分裂, 產(chǎn)生一原產(chǎn)孢絲細胞, 由它連續(xù)斜分裂形成產(chǎn)孢絲基部細胞?；考毎^續(xù)橫分裂, 形成產(chǎn)孢絲。當產(chǎn)孢絲聚集到 5～6個細胞的時候, 在輔助細胞和產(chǎn)孢絲之間的紋孔聯(lián)系擴大。接著, 產(chǎn)孢絲基部細胞與第一次分裂后的輔助細胞融合, 形成一個小的融合胞。髓絲和融合胞之間形成次級紋孔聯(lián)系。產(chǎn)孢絲附近的髓絲逐漸纏繞, 并通過次級紋孔聯(lián)系相互連接形成一個絲狀囊果被, 頂端有時可以看到一囊孔。產(chǎn)孢絲從末端開始成熟, 最后形成為梨形或橢圓形的果孢子囊。成熟囊果中, 產(chǎn)孢絲除基部細胞外全部形成果孢子囊, 寬 9～10 μm, 長 11～12 μm(圖 2d-e)。

四分孢子始于內(nèi)皮層細胞, 十字形分裂(圖2f-h)。成熟的四分孢子囊長 34～38 μm, 寬 12～15 μm。精子囊母細胞由表皮細胞形成, 第一次縱向分裂, 伸長,再橫分裂, 產(chǎn)生精子囊。

2.4 東方蜈蚣藻與其相似種的形態(tài)學比較

通過東方蜈蚣藻與其相似種進行形態(tài)學特征比較(表 3), 可以看出東方蜈蚣藻與繁枝蜈蚣藻較容易分辨： 東方蜈蚣藻具不規(guī)則羽狀分枝; 繁枝蜈蚣藻具不規(guī)則叉狀分枝或互生分枝。東方蜈蚣藻和蜈蚣藻(G. filicina)在外形上較難分辨, 且東方蜈蚣藻曾經(jīng)被當作G. filicina[13-14]研究, 但是, 可以通過其藻體直徑和皮層數(shù)分辨： 東方蜈蚣藻藻體直徑為0.2～0.3 mm×0.3～1.5 mm, 皮層為 6～9 層;G. filicina藻體直徑為350～450 μm, 皮層為5～8層。東方蜈蚣藻與鏈狀蜈蚣藻在外形上極為相似, 很難分辨。

習性： 生長在中、低潮帶巖石上或潮下帶0.5～2 m的巖石上。產(chǎn)地： 中國海南省陵水新村、中國臺灣林園模式標本產(chǎn)地： 中國臺灣林園

表3 東方蜈蚣藻及其近似種的形態(tài)學比較Tab. 3 Comparison of morphological features between Grateloupia orientalis and its similar species

2.5rbcL分析

全序列比對結(jié)果如表 4所示。編號為LNU092102和 LNU092103的標本與東方蜈蚣藻三者之間無堿基差異, 與屬模蜈蚣藻(G. filicina)的堿基差異為 8.2%(72 bp), 與繁枝蜈蚣藻(G. ramossissima)的堿基差異為 8.3%(73 bp), 與鏈狀蜈蚣藻(G.catenata)的堿基差異為 8.1%(67 bp), 與蜈蚣藻屬內(nèi)其他各種的堿基差異為 8.65%～9.3%(79～91 bp), 與外群(Polyopes lancifolius,Halymenia floresia)的堿基差異為 10.0%～10.4%(118～127 bp)。

圖3 NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 The phylogeny tree based on Neighbor-Joining比例尺為0.01, 表示遺傳距離; 分支上的數(shù)字表示支持率(1000次重復), 支持率小于50%的沒有給出Scale bar=0.01 substitutions per site. Numbers at nodes are bootstrap values; the numbers lower than 50% are not shown

圖4 MP法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 The phylogeny tree based on Maximum Parsimony分支上的數(shù)字表示支持率, 支持率小于50%的沒有給出Numbers at nodes are bootstrap values; the numbers lower than 50% are not shown

從NJ系統(tǒng)樹(圖3)和MP系統(tǒng)樹(圖4)中可以看出, 18個海膜科的物種聚集為3個大的進化支, 其中,編號為LNU092102, LNU092103的標本與蜈蚣藻屬內(nèi)的其他各種聚集為一個大的進化支, 與蜈蚣藻屬中的屬模蜈蚣藻(G. filicina)、東方蜈蚣藻(G. orientalis)、繁枝蜈蚣藻(G. ramossissima)、鏈狀蜈蚣藻(G.catenata)形成一個小分支, 并與東方蜈蚣藻(G. orientalis)組成一個單獨的分支, 區(qū)別于其他物種, 其支持率達100%。

3 討論

蜈蚣藻屬(GrateloupiaC.Agardh)是海膜科(Halymeniaceae)中最大的一個屬, 其外部形態(tài)變化很大。許多分類學家都不同程度地對蜈蚣藻屬做了分類學研究。

2008年, 林繡美等[11]首次報道了分布在臺灣林園的新種東方蜈蚣藻(G. orientalisS.-M. Lin et H.-Y.Liang), 并描述了該種的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。本文采用形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和rbcL基因序列分析相結(jié)合的方法,對海南沿海蜈蚣藻資源進行了調(diào)查, 發(fā)現(xiàn)編號為LNU092102和 LNU092103的海藻樣本的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征與林繡美報道過的東方蜈蚣藻相同, 經(jīng)rbcL基因序列分析, 二者無堿基差異, 并且在系統(tǒng)樹上也聚為一個進化支, 因此斷定該種即為東方蜈蚣藻。由于該種只在中國臺灣有過報道, 在海南省為首次發(fā)現(xiàn), 故將其確定為海南新紀錄種。

對該藻進行的內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察的結(jié)果顯示, 其果孢枝細胞和輔助細胞生殖枝叢是典型的蜈蚣藻型,并與東方蜈蚣藻具有相同的結(jié)構(gòu)特點： 藻體質(zhì)地凝膠狀或軟骨質(zhì); 皮層外部由 5～6層念珠狀的細胞構(gòu)成, 內(nèi)部由1～2層星形細胞構(gòu)成; 生殖枝叢由兩個分枝組成; 果孢子囊分布在除藻體基部外的皮層內(nèi);受精后, 產(chǎn)孢絲細胞鄰近的內(nèi)皮層細胞, 產(chǎn)生次生髓絲, 最后發(fā)育為囊果被。

通過東方蜈蚣藻與其相似種的形態(tài)學特征比較,可以看出東方蜈蚣藻與繁枝蜈蚣藻較容易分辨, 與蜈蚣藻(G. filicina)和鏈狀蜈蚣藻在外形上較難分辨,但與蜈蚣藻(G. filicina)可通過藻體直徑和皮層數(shù)分辨開來。

rbcL序列分析的結(jié)果顯示, 編號為LNU092102和LNU092103的標本與東方蜈蚣藻的序列相似度高達100%, 與其外形相似的繁枝蜈蚣藻、蜈蚣藻以及鏈狀蜈蚣藻的差異為種間差異, 與海膜科內(nèi)海膜屬(Halymenia)和海柏屬(Polyopes)的差異較大, 超過了種間差異的范圍。在基于rbcL基因(1381 bp)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3和圖4)中可以看出, 該藻與東方蜈蚣藻聚成了一個單獨的分支, 區(qū)別于其他種類, 并且, 東方蜈蚣藻與蜈蚣藻屬內(nèi)的其他種形成了一個大的進化支。這不僅證明了該藻與東方蜈蚣藻是同一物種, 也進一步驗證了東方蜈蚣藻 是蜈蚣藻屬內(nèi)的一個獨立的物種。

[1] Agardh C A. Species Algarum[M]. Lundae： ex officina Berlingiana, 1822： 169-398.

[2] 夏邦美.中國海藻志. 第二卷. 紅藻門. 第三冊[M].北京： 科學出版社, 2004： 59-81.

[3] Wang H W, Kawaguchi S, Horiguchi T,et al. A morphological and molecular assessment of the genus Prionitis J. Agardh (Halymeniaceae, Rhodophyta)[J].Phycol Res, 2001, 49：251-262.

[4] Wang, H W, Kawaguchi S, Horiguchi T, et al. Reinstatement of Grateloupia catenata (Rhodophyta, Halymeniaceae) on the basis of morphology and rbcL sequences[J]. Phycologia 2000, 39： 228-237.

[5] Kawaguchi S, Wang H W, Horiguchi T, et al. A comparative study of the red alga Grateloupia filicina (Halymeniaceae) from the northwestern Pacific and Mediterranean with the description of Grateloupia asiatica sp. nov. [J]. J Phycol, 2001, 37：433-442.

[6] Gavio B, Fredericq S. Grateloupia turuturu (Halymeniaceae, Rhodophyta) is the correct name of the non-native species in the Atlantic known as Grateloupia doryphora[J]. Phycol, 2002, 37： 349-360.

[7] Faye E T, Wang H W, Kawaguchi S, et al.Reinstatement of Grateloupia subpectinata (Rhodophyta, Halymeniaceae) based on morphology and rbcL sequences[J]. Phycol Res, 2004, 52： 59-68.

[8] De Clerck O, Gavio B, Fredericq S, et al. Systematics of Grateloupia filicina (Halymeniaceae, Rhodophyta),based on rbcL sequence analyses and morphological evidence, including the reinstatement of G. minima and the description of G. capensis sp. nov.[J]. J Phycol,2005a, 41： 391-410.

[9] De Clerck O, Gavio B, Fredericq S, et al. Systematic reassessment of the red algal genus Phyllymenia(Halymeniaceae, Rhodophyta)[J]. Eur J Phycol, 2005b,40： 169-178.

[10] Wilkes R J, McIvor L M, Guiry M D. Using rbcL sequence data to reassess the taxonomic position of some Grateloupia and Dermocorynus species(Halymeniaceae, Rhodophyta) from the north-eastern Atlantic[J]. Eur J Phycol, 2005,40：53-60.

[11] Lin S M, Liang H Y, Hommersand M H. Two types of auxiliary cell ampullae in Grateloupia (Halymeniaceae,Rhodophyta ), including G. taiwanensis sp. nov. and G.orientalis sp. nov. from Taiwan based on rbcL gene sequence analysis and cystocarp development[J].Journal of Phycology, 2008, 44(19)：196-214.

[12] Kimura M. A simple method for estimating rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences[J]. Journal of Molecular Evolution, 1980, 16：111-120.

[13] Chiang Y M. Marine algae of northern Taiwan(Rhodophyta)[J]. Taiwania, 1962, 8： 167-180.

[14] Chiang Y M. Notes on marine algae of Taiwan[J]. Taiwania, 1973, 18：13-17.

Morphological observation and rbcL gene sequence analysis of Grateloupia orientalis (Rhodophyta), a new record of the Hainan province

ZHANG Wen1, WANG Hong-wei1, ZHAO Dan1, SHENG Ying-wen1,LUAN Ri-xiao2
(1. College of Life Sciences, Liaoning Normal University, Dalian 116029, China; 2. Dalian Natural History Museum, Dalian 116023, China)

Nov.,12,2011

halymeniaceae; Grateloupia orientalis; new record; morphological observations; rbcL

The Grateloupia orientalis S.-M. Lin et H.-Y.Liang collected from Lingshui, Hainan province has been confirmed to be a new record in the Hainan province through morphological observations, development of reproductive structures and molecular phylogenetic studies. This species has the following morphological features：Thallus are gelatinous to cartilaginous in texture; cortex is composed of five to six layers of outer moniliform cells and one to two layers of stellate-shape inner cells; ampullae is composed of only two orders of unbranched filament;carposporangia distribute in all the cortex except the bottom of thallus.

Q943

A

1000-3096(2012)07-0109-08

2011-11-12;

2012-03-23

國家自然科學基金項目(30870161)

張雯(1986-) 女, 山東萊蕪人, 碩士研究生, 從事海藻分類學研究, E-mail： zhangwen111213@126.com; 王宏偉, 通信作者, 教授,博士, 從事海藻分類、多樣性及其分子系統(tǒng)學研究, E-mail： kitamiwang@yahoo.com.cn

(本文編輯：梁德海)