葛 亮, 房耀維, 吳文惠, 王淑軍, 呂明生, 焦豫良, 劉 姝

(1. 上海海洋大學 食品學院, 上海 201306; 2. 淮海工學院 海洋學院, 江蘇 連云港市 222005)

海洋細菌LP621右旋糖苷酶分批發(fā)酵動力學研究

葛 亮1,2, 房耀維2, 吳文惠1, 王淑軍2, 呂明生2, 焦豫良2, 劉 姝2

(1. 上海海洋大學 食品學院, 上海 201306; 2. 淮海工學院 海洋學院, 江蘇 連云港市 222005)

對海洋細菌Pseudoalteromonas tetraodonis LP621右旋糖苷酶進行了50L發(fā)酵罐分批發(fā)酵的代謝特性的研究。結果表明LP621右旋糖苷酶合成和菌體生長呈部分生長偶聯(lián)型。據(jù)分批發(fā)酵試驗結果采用 Logistic方程、Luedeking-Piret方程建立了描述菌株生長、產(chǎn)酶以及葡萄糖底物消耗分批發(fā)酵動力學模型。動力學模型計算值結果與實驗值擬合良好, 較好反映了菌株右旋糖苷酶分批發(fā)酵過程的動力學特征。

右旋糖苷酶; 海洋細菌; 發(fā)酵動力學模型; Logistic方程; Luedeking-Piret方程

右旋糖苷酶(EC 3.2.1.11)可以切斷α-1, 6糖苷鍵,能夠有效阻滯唾液糖蛋白和粘性葡聚糖所組成的口腔牙菌斑形成, 對齲病的防治具有重要的意義[1-2]。同時, 右旋糖苷酶可以用于催化水解高分子右旋糖苷合成血漿替代品, 在制糖工業(yè)中也可以用來增加糖的回收率, 降低黏度[3]。另外, 它可以增強藥物的化學穩(wěn)定性和生物利用度[4]。

目前國內(nèi)外文獻報道的右旋糖苷酶生產(chǎn)菌株多來為陸生微生物, 存在的主要問題是酶的最適作用溫度高(大多在50℃以上), 酶的最適作用pH低(大多pH 5), 從而導致抑制牙菌斑的效果差, 而海洋微生物因其生活的環(huán)境溫度較低, 其產(chǎn)生的酶在較低溫度下仍具有較高的活性。海洋交替假單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)LP621的生長溫度為4～37℃, 最適生長溫度為 25℃; 在 pH 6. 0～11. 0 條件下生長良好。該菌產(chǎn)生的右旋糖苷酶作用溫度低(30℃), 耐熱性較好, 具有較好的應用前景[5]。

為了更有效地控制發(fā)酵生產(chǎn)[6-7], 提高右旋糖苷酶得率, 本文結合搖瓶發(fā)酵條件和發(fā)酵罐優(yōu)化的發(fā)酵數(shù)據(jù), 通過測定細胞濃度、基質(zhì)消耗、產(chǎn)物濃度等對時間變化的情況, 觀察了海洋細菌LP621在50 L發(fā)酵罐的生長及產(chǎn)物生成情況, 建立了細胞生長、產(chǎn)物形成和基質(zhì)消耗的動力學模型。

1 材料與方法

1.1 菌株

交替假單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)LP621[5], 由淮海工學院海洋學院保藏。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/100mL)： 2216E 培養(yǎng)基, 酵母粉0.1, 蛋白胨0.5, pH8.0, 陳海水配制。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/100mL)： 玉米淀粉0.61, 豆餅粉0.4,氯化鈉4, 磷酸二氫鉀0.1, 硫酸鎂0.05, pH6.55。

1.3 主要儀器與設備

50 L全自動發(fā)酵罐 MCGS, 上海佰倫科技生產(chǎn); Synergy HT型酶標儀, 美國BioTek公司產(chǎn)品;分光光度計, 752型, 上海分析儀器廠生產(chǎn);DK-S24型電熱恒溫水浴鍋, 上海精宏實驗設備有限公司生產(chǎn)。

1.4 種子液制備

從 LP621斜面上挑菌一環(huán)接于 2216E培養(yǎng)基,25℃, 180 r/min, 培養(yǎng)12 h左右, 再以1%(v/v)的接種量接入750 mL 2216E培養(yǎng)基中, 25℃, 180 r/min, 搖瓶培養(yǎng)12 h, 作為種子液。

1.5 發(fā)酵罐發(fā)酵

在50L發(fā)酵罐中裝入30 L發(fā)酵培養(yǎng)基, 接種量為 2.5%, 溫度控制在 25℃, 在 0～4 h控制通氣量為200 L/h, 轉速為250 r/min, 4～24 h控制通氣量為500L/h, 轉速350 r/min, 接種前加入終濃度為0.4%的誘導劑右旋糖苷進行誘導培養(yǎng)。每隔2 h取樣150 mL進行菌體干質(zhì)量、殘?zhí)呛兔富盍Φ臏y定。文中所有實驗設3個重復, 數(shù)據(jù)均為3個重復的平均值。

1.6 分析方法

1.6.1 菌體干質(zhì)量測定

取100 mL發(fā)酵液, 10 000 r/min離心5 min, 棄去上清液, 用蒸餾水洗滌將沉淀洗滌, 相同條件離心, 棄上清, 重復3次, 再用蒸餾水洗滌后轉移到干燥皿, 80℃烘干到恒質(zhì)量, 稱質(zhì)量, 即為100 mL菌體的干質(zhì)量, 換算單位為g/L[8]。

1.6.2 殘?zhí)菧y定

用硫酸蒽酮法測定殘?zhí)? 即取離心并稀釋一定濃度的發(fā)酵液1.0 mL于15 mL刻度試管中, 加入蒽酮試劑3 mL迅速浸入冰水浴中, 再用95℃水浴加熱6 min, 冷卻, 在分光光度儀上測波長625 nm處吸光度, 通過標準曲線計算殘?zhí)堑牧縖9]。

1.6.3 酶活力測定

將發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min, 取上清液作為粗酶液, 將100 μL粗酶液加入到100 μL 1%的右旋糖苷緩沖液中, 在30℃水浴反應15 min, 用3,5－二硝基水楊酸(DNS)法測定還原糖量。酶活力單位定義： 在上述反應條件下, 每分鐘催化產(chǎn) 1 μg麥芽糖的酶量為一個活力單位。

2 結果與討論

2.1 分批發(fā)酵實驗的特征

海洋細菌LP621菌株在50 L發(fā)酵罐上分批發(fā)酵的過程曲線如圖1所示, 由圖1可知, 菌體在接種以后短時間內(nèi)就進入快速生長期, 在8～20 h間保持較快生長速度, 當發(fā)酵到20 h時細菌進入生長穩(wěn)定期,菌體干質(zhì)量保持相對穩(wěn)定; 產(chǎn)酶曲線走勢基本接近細胞干質(zhì)量曲線趨勢, 隨時間增長, 酶活逐漸升高,當發(fā)酵20 h時, 酶活達到最高值44.97 U/mL, 隨后顯著下降。海洋細菌 LP621產(chǎn)右旋糖苷酶發(fā)酵水平與目前國內(nèi)外報道的細菌相比較高, 但仍然不及部分真菌來源的右旋糖苷酶發(fā)酵水平, 如 Stefan等[10]于2007年分離到一株酵母菌Lipomyces starkeyi酶活力可達到83.9 U/mL。然而, LP621產(chǎn)生的右旋糖苷酶憑借發(fā)酵周期短, 安全性高, 耐熱性好, 最適作用溫度接近人體口腔溫度等特點, 使得它在人類牙菌斑的抑制的方面有著難以比擬的優(yōu)勢。

圖1 右旋糖苷酶在50L發(fā)酵罐分批發(fā)酵過程曲線Fig. 1 The batch cultivation curve of LP621 in 50L fermenter

基質(zhì)的消耗在發(fā)酵初期速度較慢, 4 h后下降趨勢顯著, 在24 h后降到2.70 g/L左右。從菌體生長與右旋糖苷酶合成的關系來看, LP621產(chǎn)生右旋糖苷酶的發(fā)酵應屬部分生長偶聯(lián)型。

2.2 發(fā)酵動力學模型的建立與擬合分析

2.2.1 菌體生長動力學模型的建立與擬合分析

2.2.1.1 模型建立

由圖1可知, LP621的生長曲線接近典型的S型曲線, 采用Logistic方程能夠較好地描述菌體的生長規(guī)律, 反映出分批發(fā)酵過程中, 因菌體濃度的增加對自身生長存在的抵制作用, 并能較好地擬合分批發(fā)酵過程的菌體的生長規(guī)律。

Logistic 方程：

式中,X為細胞質(zhì)量濃度(g/L);t為時間(h);μ為比生長速率(h-1)

初始條件, 當t=t0時,X=X0, 積分得：

式中,μmax為最大比生長率(h);Xmax為菌體生長上限(g/L)。分批發(fā)酵開始時, 菌體濃度很低,X/Xmax項可忽略不計, 式(1)表示菌體呈指數(shù)生長; 對數(shù)生長結束后, 在穩(wěn)定期時X=Xmax, 式(1)表示菌體停止生長[11]。

應用Origin8.1軟件編程, 進行非線性擬合處理,確定參數(shù)估計值, 并求出參數(shù)的置信區(qū)間, 結果見表1。

表1 動力學模型參數(shù)估計Tab. 1 Parameter values used for testing the model

將參數(shù)代入上述方程, 非線性擬合確立的細胞動力學模型為：

2.2.1.2 擬合分析

由圖 2可知, 模型計算細胞干質(zhì)量的數(shù)據(jù)與實際測得的數(shù)據(jù)基本吻合, 實驗值與模型值平均相對誤差為 7.8%, 這說明 Logistic方程能夠較好的模擬50 L發(fā)酵罐海洋細菌產(chǎn)右旋糖苷酶過程中的菌體干質(zhì)量隨時間的變化過程, 擬合曲線較為理想。進入穩(wěn)定期的實驗值的點比模型值較高, 可能與營養(yǎng)物質(zhì)消耗以及細胞利用率有關。

圖2 菌體生長的實驗值與模型計算值比較Fig. 2 Comparison of experimental data with calculated data of cell growth

2.2.2 產(chǎn)物生成動力學模型的建立與擬合分析

2.2.2.1 模型建立

微生物的產(chǎn)物形成過程非常復雜, 為便于研究,提出了一些定性的描述, 其中 Gaden的觀點被廣泛接受, Gaden[12]將產(chǎn)物形成分為 3類： 生長偶聯(lián)型,即只是在菌體生長時才有產(chǎn)物的生成; 部分生長偶聯(lián)型或稱混合型, 即菌體生長階段有部分產(chǎn)物生成,而大部分產(chǎn)物是在菌體生長穩(wěn)定期生成的; 非生長偶聯(lián)型, 即只有在菌體進入穩(wěn)定期以后產(chǎn)物才開始生成。Luedeking等[13]為此總結了下式描述產(chǎn)物形成與細胞生長的關系。

當α＞0,β=0 時, 為生長偶聯(lián)型; 當α＞0,β＞0 時,為部分生長偶聯(lián)型; 當α=0,β＞0時, 為非生長偶聯(lián)型。由圖1可知, 本實驗產(chǎn)物形成與菌株生長的關系屬于部分生長偶聯(lián)型, 故可用 Luedeking-Piret方程來描述其產(chǎn)物生成動力學模型。

應用 Origin8.1軟件編程, 將式(3)和(4)代入方程,逐步迭代進行擬合處理, 確定參數(shù)估計值(α、β見表1), 并求出參數(shù)的置信區(qū)間, 代入?yún)?shù)估計值, 得到產(chǎn)物生成動力學模型：

2.2.2.2 擬合分析

2.2.3 基質(zhì)消耗動力學模型的建立與擬合分析

2.2.3.1 模型建立

發(fā)酵過程中, 淀粉消耗主要用于細菌的生長、基本生命活動的維持和代謝產(chǎn)物的生成 3個部分。為方便建模的簡化, 可將維持生命活動的基質(zhì)消耗包括在長菌階段, 因此右旋糖苷酶的分批發(fā)酵過程限制性基質(zhì)的消耗就可用下式來描述：

式中,k1表示用于菌體生長的底物消耗常數(shù);k2表示用于產(chǎn)物形成的底物消耗常數(shù)。

應用 Origin8.1 軟件編程, 將式(3)、(4)和(6)代入方程, 逐步迭代進行擬合處理, 確定參數(shù)估計值(k1、k2見表1), 并求出參數(shù)的置信區(qū)間, 代入?yún)?shù)估計值,得到產(chǎn)物生成動力學模型：

2.2.3.2 擬合分析

由圖3可知, 在0～24 h內(nèi), 實驗值與模型計算值的平均相對誤差為 3.4%, 說明所用模型能夠較好的描述整個右旋糖苷酶隨時間增長的積累過程, 由動力學模型和擬合圖形可以看出, 在達到穩(wěn)定期前右旋糖苷酶形成的類型屬于生長偶聯(lián)型。由圖 4可以看出, 該模型能較好地描述海洋細菌 LP621產(chǎn)右旋糖苷酶發(fā)酵過程中淀粉的消耗情況, 實驗值與模型值的平均相對誤差為 7.1%, 說明所擬合曲線能夠較好的反映基質(zhì)消耗與時間的關系, 在接近穩(wěn)定期時,實驗值比模型計算值偏低, 可能是由于底物消耗與菌體生長的不均一所造成的。

圖3 酶活力的實驗值與模型計算值比較Fig. 3 Comparison of experimental data with calculated data of amylase activity

3 結論

圖4 殘?zhí)堑膶嶒炛蹬c模型計算值比較Fig. 4 Comparison of experimental data with calculated data of glucose consumption

本研究在搖瓶發(fā)酵條件的基礎上, 探討在 50L發(fā)酵罐分批發(fā)酵條件和動力學特征。建立了 3個發(fā)酵動力學模型, 包括細胞生長動力學模型、產(chǎn)物生成動力學模型和基質(zhì)消耗動力學模型。這3個發(fā)酵動力學模型方程能較好地描述海洋細菌 LP621產(chǎn)右旋糖苷酶發(fā)酵的細胞生長動力學、產(chǎn)物生成動力學和基質(zhì)消耗動力學情況, 解釋其動力學規(guī)律, 具有很好的適用性, 可為實際發(fā)酵過程中細胞生長、產(chǎn)物合成及底物消耗情況的預測與控制提供了理論依據(jù), 為工業(yè)化生產(chǎn)設計優(yōu)化以及經(jīng)濟分析等奠定基礎。

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Kinetics analysis for dextranase of Pseudoalteromonas tetraodonis LP621 by liquid fermentation

GE Liang1,2, FANG Yao-wei2, WU Wen-hui1, WANG Shu-jun2, Lü Ming-sheng2,JIAO Yu-liang2, LIU Shu2
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. School of Marine Science, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

Dec.,24,2011

dextranase; marine bacteria; fermentation kinetic model; logistic equation; luedeking-Piret equation

The kinetics for dextranase of marine bacteria Pseudoalteromonas tetraodonis LP621 by liquid fermentation was studied. The results showed that the dextranase production was partially associated with the growth of LP621. Based on the result of batch fermentation, the kinetic models for cell growth, dextranase formation, sugar consumption were set up using Logistic equation and Luedeking-Piret equation. The calculated results of models well matched the experimental data. The model equations could well reflect the dextranase fermentation process and kinetic characteristic.

Q815

A

1000-3096(2012)07-0039-05

2011-12-24; 2012-03-22

國家高技術研究發(fā)展計劃項目(2011AA09070302)

葛亮(1984-), 男, 碩士研究生, 研究方向為海洋天然產(chǎn)物化學, E-mail： frankgl@163.com; 王淑軍, 通信作者, 教授, 博士, 研究方向為海洋微生物活性物質(zhì), 電話： 0518-85895421, E-mail：shujunwang86@163.com

(本文編輯：梁德海)