王惠利，趙曉明

（1.運(yùn)城農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西運(yùn)城044000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

金銀花別名二花、忍冬花，為忍冬科攀緣灌木植物[1]。其具有清熱解毒、涼風(fēng)散熱功效[2]。金銀花為大宗名貴中藥材，主產(chǎn)于我國[3-6]，但目前以農(nóng)家品種為多，人工培育的優(yōu)良品種較少，且產(chǎn)量較低，生產(chǎn)不規(guī)范，質(zhì)量差異較大，難以符合國際市場(chǎng)要求。而多倍體植株由于染色體的加倍，植株的細(xì)胞和器官表現(xiàn)出“巨型性”的顯著特征[7]，能增大植株的營養(yǎng)器官。藥用金銀花染色體加倍后，花巨型化，能較好地滿足生產(chǎn)要求。

本試驗(yàn)采用改良L.D.Cua法對(duì)金銀花進(jìn)行多倍體誘變育種研究，以期獲得多倍體金銀花新品種，增加中草藥的種質(zhì)資源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為忍冬科（Carprifoliaceae）忍冬屬（Lonicera L.）二倍體金銀花（Lonicera japonica Thunb）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 二倍體金銀花多倍體的誘變

1.2.1.1 二倍體金銀花的播種 采用溫湯浸種法將二倍體金銀花種子浸種24 h后播于營養(yǎng)缽中（每個(gè)營養(yǎng)缽播10粒左右），覆2 cm厚的土。播種后每隔一段時(shí)間澆一次水，以保持營養(yǎng)缽充分濕潤，利于金銀花種子的正常萌發(fā)。

1.2.1.2 秋水仙素溶液的配制 （1）0.4%秋水仙堿母液的配制。將1 g秋水仙堿倒入棕色小口瓶中，先用少量95%的分析純酒精溶解，再加去離子水定容到250mL，然后放入冰箱4℃保存待用。（2）0.2%秋水仙堿溶膠＋1%瓊脂溶膠的配制。稱取0.2 g瓊脂，加去離子水10 mL，倒入60 mL燒杯中，標(biāo)記刻度，加熱到瓊脂全部溶解為止，然后定容至刻度。待燒杯冷卻后加10 mL已配好的0.4%秋水仙堿母液，混勻，水密保存待用。（3）將0.2%秋水仙堿與1%瓊脂凝膠水浴加熱到37℃充分?jǐn)嚢韬蠹纯捎糜谡T變。

1.2.1.3 改良L.D.Cua法處理金銀花幼苗 營養(yǎng)缽中金銀花出土后，待其子葉展開、頂端分生組織剛剛開始萌動(dòng)時(shí)，每天早晨用牙簽取少量0.2%秋水仙堿溶膠＋1%瓊脂溶膠滴于芽上，并充分包裹芽和子葉柄基部，分別處理24，48，72 h，誘變后蓋上透明塑料杯，處理結(jié)束后去營養(yǎng)缽，待秋水仙堿凝膠充分干燥時(shí)用尖鑷子撕去凝膠，停止誘變，以此來精確控制誘變時(shí)間。

1.2.2 M1變異植株的早期形態(tài)鑒定 在誘變處理后開始定期觀察、記錄幼苗生長發(fā)育狀況，并測(cè)量葉長、葉寬、株高、葉形等，觀察變異情況，并統(tǒng)計(jì)變異率。

1.2.2.1 M1變異株和對(duì)照株葉片形態(tài)的比較和測(cè)定 分別隨機(jī)選取M1變異株和對(duì)照株植株上相同部位的20片葉片作為樣本。每片葉選擇不同部位做切片5張，在顯微鏡下觀察，用顯微測(cè)微尺測(cè)量切口橫截面，得葉片的厚度，用直尺測(cè)量葉片的葉長和葉寬。用打孔測(cè)定法測(cè)定葉片面積。用葉片打孔器（1.5～2.0 cm）取下一定面積（A1）的葉片，將它與剩余部分的葉片分別烘干，求出打孔取樣的干葉質(zhì)量（W1）和其余部分的干葉質(zhì)量（W2），即可求出該葉片的面積（A）[8]。

1.2.2.2 M1變異株和對(duì)照株葉表皮顯微特征觀察與測(cè)定 在M1變異株和對(duì)照株植株中各隨機(jī)選擇10株，取每株相同部位的葉片為樣本，用尖嘴鑷子輕輕撕取葉片下表皮，置于潔凈的載玻片上，滴加一小滴1%的I-KI染液，靜置10 min后，在顯微鏡下觀察并用測(cè)微尺測(cè)量，測(cè)量時(shí)每個(gè)處理和對(duì)照隨機(jī)選取10個(gè)氣孔測(cè)量其長與寬；測(cè)得視野圓面積的直徑后計(jì)算出氣孔密度（氣孔數(shù) /cm2）。

1.2.2.3 M1變異株和對(duì)照株葉片葉綠素含量及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)的測(cè)定 用SPAD-502葉綠素儀測(cè)量對(duì)照株和變異株相同部位（第4片真葉）的相對(duì)葉綠素含量。保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)直接在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用SARS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼苗早期形態(tài)鑒定結(jié)果

按照公認(rèn)的多倍體形態(tài)與二倍體形態(tài)的差異，多倍體的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：（1）生長受阻；（2）葉色濃綠；（3）葉片皺縮；（4）植株畸形。可以此作為變異植株篩選的初步標(biāo)準(zhǔn)。

依據(jù)幼苗早期多倍體形態(tài)鑒定標(biāo)準(zhǔn)，用0.2%的秋水仙堿處理金銀花的幼苗頂芽時(shí)，處理時(shí)間為72 h的誘變效果最佳。處理24 h，誘變率達(dá)32.5%；處理48 h，誘變率達(dá)51.3%；處理72 h，誘變率達(dá)72.5%，且死亡率較低，誘變效果較好（表 1）。

表1 秋水仙素對(duì)金銀花幼苗的誘變效果

2.2 M1變異株和對(duì)照株形態(tài)學(xué)的比較

2.2.1 M1變異株和對(duì)照株葉片形態(tài)及葉形指數(shù)的比較 葉片皺縮、葉色濃綠、葉片大而厚且絨毛增多是M1變異株的一個(gè)顯著表現(xiàn)。用手觸摸可明顯感覺M1變異株的葉片較對(duì)照株的葉片增厚、柔軟。

從表2可以看出，M1變異株與對(duì)照株相比，葉色濃綠、葉片絨毛及葉柄絨毛變長。M1變異株比對(duì)照株葉片寬，且明顯增大，對(duì)照株葉片為長卵圓形，而M1變異株葉片為卵圓形，而且厚度增加。

表2 M1變異株與對(duì)照株葉部形態(tài)比較

從表3可以看出，M1變異株葉片的長寬都有所增加，厚度增加近1倍，葉面積增加，葉形指數(shù)變小。對(duì)變異株和對(duì)照株的葉面積進(jìn)行顯著性測(cè)定，得到其在0.01水平上差異極顯著。M1變異株的葉部形態(tài)性狀有利于形成較大的光合作用面積，從而增加光合產(chǎn)物與干物質(zhì)的積累，這是多倍體金銀花高產(chǎn)的形態(tài)生理基礎(chǔ)。

表3 M1變異株與對(duì)照株葉片大小比較及差異顯著性分析

2.2.2 M1變異株和對(duì)照株葉表皮特征比較 對(duì)M1變異株和對(duì)照株的葉表皮各項(xiàng)特征進(jìn)行測(cè)驗(yàn)，結(jié)果表明，M1變異株較對(duì)照株的氣孔增大，密度減小。采用新復(fù)極差法[9]，對(duì)變異株與對(duì)照株的氣孔直徑的變化進(jìn)行顯著性測(cè)定，得到其在0.01水平上差異極顯著（表4）。

表4 M1變異株與對(duì)照株氣孔的比較

2.2.3 M1變異株和對(duì)照株葉片葉綠素含量及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)的比較 對(duì)M1變異株和對(duì)照株葉片的葉綠素含量和保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠體數(shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，M1變異株較對(duì)照株的葉片葉綠素含量增加，保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠體數(shù)也增多。顯著性測(cè)定表明，變異株與對(duì)照株的葉綠素含量在0.01水平上差異極顯著（表5）。

表5 M1變異株與對(duì)照株葉綠素及葉綠體數(shù)的比較

3 討論與結(jié)論

3.1 秋水仙素處理的最佳時(shí)期

因?yàn)榍锼伤刂蛔饔糜诜至阎衅诩?xì)胞，因此，處理的苗期越小，則多倍體細(xì)胞與二倍體細(xì)胞比值就越大，誘變的成功率就越高。改良L.D.Cua法對(duì)金銀花進(jìn)行多倍體誘變選擇在苗期，即子葉剛剛長出來的時(shí)期為最佳。

3.2 M1誘變成功植株早期形態(tài)特征的判定標(biāo)準(zhǔn)

3.2.1 生長受阻 由于秋水仙堿是一個(gè)重要的細(xì)胞毒物，會(huì)嚴(yán)重阻礙細(xì)胞正常的生理代謝。細(xì)胞為了消除這種毒害，不得不消耗大量的能量。因此，無論該細(xì)胞是否會(huì)加倍成多倍體，只要吸收了秋水仙堿就會(huì)發(fā)生生長受阻現(xiàn)象。但是，多倍體細(xì)胞由于核染色體加倍，其90%以上的DNA加倍，這種DNA的合成和染色體的增加是非常消耗能量的。因此，多倍體細(xì)胞的分裂速率顯著慢于二倍體細(xì)胞[10-11]。

3.2.2 葉色濃綠 金銀花加倍以后多倍體的葉綠體要比二倍體細(xì)胞增加1倍左右[12]。雖然葉綠體有自己獨(dú)立的DNA遺傳系統(tǒng)，但它的遺傳受到核基因的控制，所以當(dāng)核染色體加倍后，由于染色體增加產(chǎn)生的基因劑量效應(yīng)，會(huì)使葉綠體的數(shù)目增加。這樣就會(huì)造成多倍體較二倍體的葉色濃綠。

3.2.3 葉片皺縮 因?yàn)樵谝粋€(gè)相對(duì)短的誘變時(shí)間內(nèi)，只有部分中期細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)化為多倍體，其他細(xì)胞還是二倍體，這樣造成二倍體細(xì)胞和多倍體細(xì)胞的嵌合；又由于多倍體細(xì)胞與二倍體細(xì)胞生長速率與細(xì)胞體積不同，因此，2種細(xì)胞的后代細(xì)胞體積是不一樣的，就造成了葉片的皺縮。

3.2.4 植株畸形 在化學(xué)誘變中，由于秋水仙堿破壞了紡錘體的形成，造成了紡錘體的動(dòng)物極和植物極的紊亂[13]。因此，在它的后代中會(huì)出現(xiàn)單極、三極和四極畸形現(xiàn)象。因此，我們?cè)谛螒B(tài)學(xué)上經(jīng)?？吹蕉啾扼w植株當(dāng)代發(fā)生葉片的扭曲、殘缺、頂端優(yōu)勢(shì)喪失和改變；有性繁殖器官（花包括花萼、花瓣、子房和花藥）發(fā)生畸形，出現(xiàn)花粉的敗育、不受精現(xiàn)象、多花粉受精現(xiàn)象。在后代中，胚發(fā)育不正常；胚乳不發(fā)育；單子葉現(xiàn)象，三子葉現(xiàn)象，四子葉現(xiàn)象等等。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，誘變后的多倍體金銀花植株在早期形態(tài)上與二倍體植株有明顯差異，所以，根據(jù)以上的判斷依據(jù)可以比較迅速而準(zhǔn)確地辨別出多倍體。

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