宗 羽，何巧紅，陳恒武

（浙江大學(xué)微分析系統(tǒng)研究所，浙江杭州 310058）

0 引言

抗體微陣列技術(shù)是蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)的一個(gè)重要技術(shù)平臺(tái)，是以抗體作為捕獲分子，以點(diǎn)陣的形式固定于載體表面，利用抗原—抗體間的特異性反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的分析檢測(cè)。近年來(lái)，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究和疾病診斷、藥物篩選、毒理學(xué)和藥學(xué)、環(huán)境和食品分析等研究領(lǐng)域［1，2］。與DNA基因芯片相比，抗體微陣列芯片目前依然面臨諸多挑戰(zhàn)與困難，其中，如何將抗體高效地固定在芯片基底上是研制抗體微陣列芯片的關(guān)鍵問(wèn)題之一。近年來(lái)，人們嘗試了多種微陣列基底材料和固定技術(shù)，以增加抗體在基底表面的吸附量和穩(wěn)定性，進(jìn)而提高檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度和方法的靈敏度［3］。

聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）是一種生物兼容性良好的有機(jī)聚合物，由于具有良好的透光性、透氣性，且價(jià)格低廉，加工簡(jiǎn)單，近幾年來(lái)被廣泛用作制備微流控芯片和DNA陣列芯片的材料［4］。PDMS表面疏水，易吸附蛋白質(zhì)，因此，它是一種理想的制備抗體微陣列基底材料。為了進(jìn)一步提高PDMS表面對(duì)抗體的吸附能力，文獻(xiàn)［4～6］報(bào)道了各種物理或化學(xué)表面修飾技術(shù)，其中，改變表面形貌，增加比表面是一種有效的措施［7～9］。

本文將化學(xué)濕法刻蝕和軟刻蝕技術(shù)相結(jié)合，以HF刻蝕后的載玻片為陽(yáng)模，直接澆注制得3D微納結(jié)構(gòu)的PDMS基片，建立了一種簡(jiǎn)單、快捷、高效的抗體微陣列芯片加工新技術(shù)，并將所制得的3D結(jié)構(gòu)PDMS芯片應(yīng)用于非均相免疫分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 微納結(jié)構(gòu)表面的PDMS基片制作

1．1．1 濕法刻蝕制作具有微納結(jié)構(gòu)的玻璃陽(yáng)模

載玻片（長(zhǎng)75 mm×寬25 mm×厚1 mm）用水洗凈，吹干。載玻片的背面貼上保護(hù)用的黃膠帶，將其放入濃HF含量≥40%刻蝕液中，20℃下，恒溫振蕩，刻蝕10 min，用水洗凈，吹干，制得表面具有微納結(jié)構(gòu)的玻璃陽(yáng)模。

1．1．2 澆注法制作具有微納結(jié)構(gòu)表面的PDMS基片

按照文獻(xiàn)［10］的方法澆注PDMS，即將PDMS預(yù)聚物和固化劑以質(zhì)量比為10∶1的比例充分混合、脫氣后倒在玻璃陽(yáng)模上。待混合物鋪展均勻后，將其置于75℃下加熱1．5 h，固化、脫模，制得具有3D微納結(jié)構(gòu)表面的PDMS基片。為確保PDMS基片的厚度為1 mm，控制每次澆注所需混合物的量為40 mg/cm2。

1．2 抗體微陣列的固定與檢測(cè)

將制得的PDMS基片（3D微納結(jié)構(gòu)面朝上）置于另一潔凈的的載玻片上。將5 μL Cy3-羊抗人IgG溶液等間隔地點(diǎn)于PDMS表面，形成抗體微陣列（每點(diǎn)直徑約為2．5 mm，點(diǎn)間隔為1～2 mm）。在恒濕器（相對(duì)濕度為82%RH）內(nèi)室溫放置2 h，用細(xì)的濾紙卷吸去抗體殘液，再依次用PBS溶液、超純?nèi)ルx子水清洗數(shù)次，氮?dú)獯蹈伞?/p>

將上述吸附有Cy3-羊抗人IgG的 PDMS面朝下，緊貼于另一潔凈的載玻片上，插入生物芯片掃描儀的芯片池，檢測(cè)點(diǎn)陣斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。芯片掃描儀的實(shí)驗(yàn)參數(shù):激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)分別為543/570 nm，強(qiáng)度為80%，掃描分辨率為10 μm。

1．3 非均相免疫分析

按照1．2節(jié)相同的方法制備抗體微陣列，即先將羊抗人IgG（25 mg/L），吸附固定于PDMS表面，形成抗體微陣列。接著用1%BSA溶液室溫封閉過(guò)夜（或37℃下封閉2 h），再在各斑點(diǎn)上依次加入不同濃度的人IgG（0．01～100 mg/L）和Cy3-羊抗人IgG溶液（10mg/L），各反應(yīng)1h。每步反應(yīng)結(jié)束后，均用濾紙吸干溶液，PBS溶液和超純?nèi)ルx子水清洗數(shù)次，氮?dú)獯蹈伞Ｓ蒙镄酒瑨呙鑳x檢測(cè)斑點(diǎn)熒光強(qiáng)度。非均相免疫反應(yīng)的過(guò)程如圖1。

2 結(jié)果與討論

2．1 3D微納結(jié)構(gòu)玻璃陽(yáng)模和PDMS基片的制備與表征

圖1 微陣列芯片上的非均相免疫分析流程示意圖Fig 1 Schematic diagram of the procedure of heterogeneous immunoassay on microarray chip

以HF為刻蝕劑的化學(xué)濕法刻蝕技術(shù)常被用于加工玻璃微流控芯片的通道。玻璃含有SiO2，Na2O，CaO和MgO等主要成分，而室溫下CaF2和MgF2的溶度積常數(shù)分別為2．7 ×10－11和6．4 ×10－9，因此，HF 刻蝕玻璃過(guò)程中產(chǎn)生了難溶化合物CaF2和MgF2。隨著刻蝕的進(jìn)行，產(chǎn)生的沉淀微粒沉積在通道表面，充當(dāng)掩模層阻止HF溶液進(jìn)一步均勻地刻蝕下層玻璃，致使通道表面變粗糙［11～13］。該現(xiàn)象對(duì)于芯片毛細(xì)管電泳等分離分析是極為不利的，將嚴(yán)重影響系統(tǒng)分離的效率。

本文利用上述現(xiàn)象來(lái)制備具有3D微納結(jié)構(gòu)的玻璃陽(yáng)模。研究表明，刻蝕后玻璃表面的粗糙化程度與刻蝕速率、刻蝕時(shí)間等有關(guān)。HF濃度越大，難溶性氟化物的聚集沉降速度越快。采用濃氫氟酸作刻蝕液，可以快速地在表面形成一定厚度和致密程度的阻擋層，覆蓋在玻璃的上表面。隨著刻蝕的進(jìn)行，刻蝕液必須穿過(guò)這層阻擋層才能進(jìn)一步刻蝕玻璃表面，結(jié)果導(dǎo)致后續(xù)的刻蝕速率不均勻，刻蝕后在表面形成了凹凸結(jié)構(gòu)。圖2為不同刻蝕時(shí)間（0，5，10，20，30min）下制得的玻璃陽(yáng)模表面形態(tài)圖。由光學(xué)顯微鏡CCD圖像（a1～e1）可見(jiàn)，刻蝕后的載玻片表面出現(xiàn)μm級(jí)凹凸不平紋路，而且隨著刻蝕時(shí)間的增長(zhǎng)，表面粗糙度增加，紋路加深加密，這可能是由于刻蝕時(shí)間的延長(zhǎng)，附著在表面的沉淀阻擋層厚度、致密程度逐漸增加，刻蝕不均勻性也逐漸增加所導(dǎo)致。用原子力顯微鏡進(jìn)一步對(duì)載玻片表面的微區(qū)域進(jìn)行表征分析，結(jié)果如圖2中的（a2～e2）所示?？梢?jiàn)，經(jīng)過(guò)HF刻蝕后的載玻片表面不僅形成μm結(jié)構(gòu)，同時(shí)在微結(jié)構(gòu)內(nèi)還套有nm結(jié)構(gòu)，如果將載玻片表面的μm結(jié)構(gòu)比擬成山脈似的大地皺褶，那么，nm結(jié)構(gòu)就類似于山脈中致密樹(shù)林。經(jīng)過(guò)NanoScope 5．31R1軟件計(jì)算可知，未刻蝕的載玻片表面比較光滑，粗糙度（Rq）為 1．5 nm，經(jīng)過(guò) 5，10，20，30 min刻蝕后，微區(qū)域內(nèi)的平均粗糙度分別為 7．7，14．6，24．0，37．3 nm。因此，隨著刻蝕時(shí)間的增加，玻璃表面 nm結(jié)構(gòu)的粗糙度隨之增加。

澆注法是PDMS芯片最基本的制備方法，以玻璃為陽(yáng)模澆注PDMS，成型后易脫模。本研究以不同刻蝕程度的玻璃為陽(yáng)模澆注得到PDMS基片，其光學(xué)顯微鏡CCD圖如圖3（a1～e1）所示?？梢?jiàn)，通過(guò)澆注復(fù)制得到的PDMS基片表面與陽(yáng)模一樣具有3D結(jié)構(gòu)。

圖2 經(jīng)過(guò)不同刻蝕時(shí)間得到的顯微鏡玻璃陽(yáng)模表面形態(tài)圖（a1～e1）為CCD圖;（a2～e2）為AFM圖;刻蝕條件:濃HF含量≥40%，20℃Fig 2 Morphological images of glass templates by microscope at different etching time（a1 ～e1）CCD images，（a2 ～ e2）AFM images．tching conditions:hydrofluoric acid（HF content of≥ 40%），20℃

圖3 顯微鏡下PDMS基片的表面形態(tài)圖（a1～e1）為CCD圖;（a2，b2）分別為HF未刻蝕和刻蝕10 min的玻璃陽(yáng)模復(fù)制所得的PDMS表面AFM圖Fig 3 Morphological images of PDMS templates．（a1 ～ e1）CCD images，（a2，b2）AFM images of PDMS substrate replicated from 0 and 10 min HF etching glass templates

從未刻蝕（平板）和刻蝕10 min的玻璃作陽(yáng)模所得的PDMS的AFM圖［圖3中的（a2，b2）］計(jì)算可知，其粗糙度分別為0．9，8．5 nm。至于復(fù)制得到PDMS基片的表面粗糙度總體比玻璃陽(yáng)模的要小，其原因是多方面的，主要原因可能是:1）兩者的材質(zhì)硬度不一樣，對(duì)AFM檢測(cè)時(shí)的響應(yīng)能力不同;2）PDMS混合液的粘度大、浸潤(rùn)性差，澆注時(shí)可能不能完全滲透至微納結(jié)構(gòu)的最底部;3）PDMS澆注成型后會(huì)可能會(huì)有些自然收縮。

2．2 PDMS表面粗糙度對(duì)抗體吸附性能的影響

考察了不同刻蝕時(shí)間下陽(yáng)模所澆注出的PDMS對(duì)抗體的吸附能力，結(jié)果如圖4所示。顯然，經(jīng)刻蝕產(chǎn)生的表面微納結(jié)構(gòu)可顯著提高PDMS對(duì)抗體的吸附能力，而且隨著刻蝕時(shí)間的增加，表面粗糙度增加，對(duì)抗體的吸附能力也逐漸增強(qiáng)。與平板PDMS（未經(jīng)HF刻蝕的玻璃為陽(yáng)模澆注所得）相比，當(dāng)刻蝕時(shí)間大于10 min，抗體的吸附量可提高5～6倍。PDMS基片上吸附的Cy-3-羊抗人IgG抗體的熒光陣列掃描圖上可以看出，各斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度比較均勻，說(shuō)明抗體的分布均勻。

此外，從圖中各點(diǎn)熒光強(qiáng)度的誤差線可以看出，刻蝕10 min以內(nèi)澆注所得的PDMS表面上形成的抗體斑點(diǎn)熒光強(qiáng)度的重現(xiàn)性良好。對(duì)于1μg/mL的Cy3-羊抗人IgG，熒光信號(hào)強(qiáng)度精密度RSD＜15%（n=15）;當(dāng)刻蝕時(shí)間超過(guò)20 min，斑點(diǎn)熒光強(qiáng)度的精密度有所下降，這可能是表面過(guò)于粗糙所引起的不均勻性所致。

圖4 PDMS表面粗糙度對(duì)抗體吸附量的影響Fig 4 Effect of surface roughness on the amount of antibody immobilized on the PDMS surface．

因此，綜合考慮表面對(duì)抗體的吸附能力和重現(xiàn)性，刻蝕時(shí)間為10 min的玻璃作PDMS的陽(yáng)模是一種較理想的選擇。

2．3 PDMS微納表面的非均相免疫分析

以刻蝕10min所得的玻璃為陽(yáng)模，澆注得到具有3D微納結(jié)構(gòu)的PDMS基片，并將其用于微陣列非均相免疫分析。以人IgG為分析模型，按照1．3節(jié)的方法進(jìn)行免疫反應(yīng)，結(jié)果如圖5所示。研究結(jié)果表明，3D結(jié)構(gòu)的PDMS基片較平板PDMS基片免疫反應(yīng)熒光信號(hào)增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度為平板PDMS基片上的5倍左右。其中，人IgG濃度在0．01～10 mg/L范圍內(nèi)，免疫反應(yīng)所得熒光強(qiáng)度與抗原濃度呈良好的線性相關(guān)性，平板和刻蝕10 min澆注所得的PDMS基片上抗原濃度—熒光強(qiáng)度的線性方程分別為

式中y為熒光強(qiáng)度，x為人IgG抗原濃度（mg/L）。

初步實(shí)驗(yàn)表明:3D微納結(jié)構(gòu)PDMS芯片可有效提高免疫分析的靈敏度。

圖5 人IgG微陣列免疫分析結(jié)果Fig 5 Result of immunoassay of human IgG microarray

3 結(jié)論

采用常規(guī)的化學(xué)濕法刻蝕技術(shù)和軟刻蝕技術(shù)相結(jié)合，研究建立了一種快速、簡(jiǎn)單、高效的抗體微陣列免疫傳感芯片制作方法。這種制作方法不需要特殊的MEMS/NEMS技術(shù)，制得的陽(yáng)模耐用性強(qiáng)，可以重復(fù)多次使用。研究結(jié)果表明:利用該方法制得的3D微納結(jié)構(gòu)PDMS芯片，可顯著提高抗體的吸附能力和免疫分析方法的靈敏度，所建立的制備方法可為構(gòu)建高效、高靈敏度的抗體微陣列檢測(cè)提供一定的技術(shù)保障。

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